發(fā)布時間：2020-04-26 00:35

【摘要】：土拉弗朗西斯菌是一種細胞內寄生的革蘭氏陰性短桿菌,可以通過呼吸道、消化道、傷口和昆蟲叮咬等多種途徑感染人類和多種動物引起土拉熱。由于土拉弗朗西斯菌對人具有很強的致病性,近年來,國內外學者針對細菌的致病機制開展了大量的研究工作。我們前期毒力因子篩選研究發(fā)現(xiàn)土拉弗朗西斯菌greA基因突變株在感染小鼠體內的存活能力顯著下降,預示該基因的表達及其產(chǎn)物影響了細菌感染和致病作用。已有的研究表明,細菌greA基因編碼轉錄延長因子GreA,其誘導的RNA聚合酶(RNAP)核酸切割活性在RNA延伸過程中可以降解停頓在復制通道中的RNA末端使其處于活性中心正確位置,進而抑制轉錄延長復合物轉錄暫停、促進RNAP從啟動子逃逸及增強基因轉錄保真性等。為探討GreA蛋白對土拉弗朗西斯菌感染及致病力的影響,本研究以土拉弗朗西斯菌新殺手亞種U112為模式菌株,利用同源重組構建了 greA基因缺失株及反式回補株,體外培養(yǎng)檢測表明:1)greA基因缺失對土拉弗朗西斯菌的菌體形態(tài)、溫度敏感性和pH敏感性無顯著影響,但greA缺失細菌繁殖的代次時間延長、對高濃度NaCl的抵抗力下降,然而,細菌的生物膜形成能力顯著增強,表明GreA影響土拉弗朗西斯菌的環(huán)境適應性;2)細胞感染實驗表明,土拉弗朗西斯菌greA基因缺失突變株對細胞的入侵及胞內增殖顯著降低。小鼠感染實驗發(fā)現(xiàn),土拉弗朗西斯菌greA缺失株經(jīng)皮下或呼吸道感染小鼠的致病力顯著下降,缺失突變株在小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中繁殖能力亦顯著低于親代,并且被快速清除,進一步證明GreA影響土拉弗朗西斯菌的致病力。為進一步探討GreA影響土拉弗朗西斯菌生理功能與致病力的分子機制,本研究利用轉錄組學(RNA-seq)技術比較分析了 greA基因缺失突變株和親代毒株基因轉錄和表達的差異。RNA-Seq分析結果表明,greA基因缺失對土拉弗朗西斯菌新殺手亞種的196個基因表達產(chǎn)生顯著的影響(相差2倍以上),這些基因除了影響細菌氨基酸、碳水化合物及無機離子代謝外,其中77個差異表達基因與土拉弗朗西斯菌的致病力相關,包括所有毒力島基因。利用β-半乳糖苷酶實驗證實pdpD、pepO、FTN_1104的啟動子活性可以被GreA調節(jié),表明GreA可以通過啟動子調控基因轉錄。為驗證GreA對毒力基因表達調控的影響,本研究構建了 FTN_1104、ampD和pepO等與細胞入侵相關的下調基因的缺失突變株,并通過細胞感染實驗證明FTN_1104和ampD缺失影響土拉弗朗西斯菌的細胞入侵。綜上,土拉弗朗西斯菌GreA蛋白可以通過調控基因啟動子等途徑影響細菌基因轉錄,進而調節(jié)細菌的環(huán)境適應性、細菌對細胞的侵染和對宿主動物的致病力。細菌GreA蛋白的保守性及其對細菌致病力的影響,也為進一步開展土拉弗朗西斯菌的預防治療提供了一種新的藥物靶標。
【圖文】：

莢膜位于細菌的最外層，根據(jù)菌株的不同，主要由多糖或多肽組成。在土拉弗朗西斯菌中，逡逑土拉亞種與全北極亞種菌體外層均含有莢膜樣物質，它們的主要成分為脂質、糖蛋白與多糖復合逡逑物［２８１（圖１－２）。先前的研究一般認為新殺手亞種不形成莢膜，但最新研究顯示，新殺手亞種菌株逡逑在適當條件下培養(yǎng)后，可以形成類似于土拉亞種的莢膜樣物質，并且這些莢膜樣物質的糖基化有逡逑助于細菌的致病力與免疫保護｜２７］。莢膜缺失菌株對血清補體更加敏感，對小鼠的致病力也隨之下逡逑降［？３２］。蘇敬良等發(fā)現(xiàn)土拉弗朗西斯菌中含有炭疽桿菌聚Ｙ谷氨酸莢膜生物合成的同源基因操縱逡逑子，并將其命名為缺失這些基因后可以導致細菌的細胞內適應性下降、對小鼠的致病逡逑力下降［３３］。但相關研究發(fā)現(xiàn)，ＣａｐＡＢＣ并不參與莢膜的合成［３２１。土拉亞種與全北極亞種莢膜多糖逡逑與ＬＰＳ的Ｏ抗原結構基本相同，因此可以將其歸類為Ｏ抗原莢膜［氣進一步研究發(fā)現(xiàn)，破壞ＬＰＳ逡逑的０抗原生物合成有關的部分糖基轉移酶基因（ｗ汾／，邐ｗ＆Ｍ邋ｗ＆Ｃ）會導致莢膜的逡逑丟失１３２），表明土拉弗朗西斯菌的０抗原莢膜與其ＬＰＳ的０抗原生物合成及組

４－２０邋ｈｒｓ邐Ｚ逡逑ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑圖１－１邋土拉弗朗西斯菌對巨噬細胞的感染逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ．邋ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ１＇８１逡逑通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，土拉弗朗西斯菌中不存在其它胞內寄生菌中普遍存在的毒素基因逡逑與分泌系統(tǒng)，同時，它也缺乏其它胞內寄生菌吞噬泡逃逸的同源基因。因此，土拉弗朗西斯菌中逡逑必然存在獨有的細胞入侵及吞噬泡逃逸機制，輔助其完成細胞感染。目前已知的與土拉弗朗西斯逡逑菌細胞感染相關的毒力因子主要包括莢膜、脂多糖（ＬＰＳ）、ＶＩ型菌毛系統(tǒng)、幾種分泌系統(tǒng)、夕卜逡逑膜蛋白、毒力島以及部分代謝基因等ｐ７］。逡逑１．３．１莢膜逡逑莢膜位于細菌的最外層，根據(jù)菌株的不同，主要由多糖或多肽組成。在土拉弗朗西斯菌中，逡逑土拉亞種與全北極亞種菌體外層均含有莢膜樣物質，它們的主要成分為脂質、糖蛋白與多糖復合逡逑物［２８１（圖１－２）。先前的研究一般認為新殺手亞種不形成莢膜，，但最新研究顯示，新殺手亞種菌株逡逑在適當條件下培養(yǎng)后，可以形成類似于土拉亞種的莢膜樣物質，并且這些莢膜樣物質的糖基化有逡逑助于細菌的致病力與免疫保護｜２７］。莢膜缺失菌株對血清補體更加敏感
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

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本文編號：2640877