發(fā)布時間：2020-04-25 11:24

【摘要】：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis Type 2,SS2)是一種重要的人豬共患病原,感染仔豬可誘發(fā)腦膜炎、關節(jié)炎、心內膜炎和敗血癥等癥狀,其中尤以腦膜炎最為嚴重,每年不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失,也嚴重威脅著公共衛(wèi)生安全。烯醇化酶(Enolase,Eno)是糖酵解過程的關鍵催化酶,可催化2-磷酸甘油酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸。近些年來,越來越多的研究發(fā)現原核生物Eno除了具有催化功能外,還在某些病原微生物感染的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本課題組前期通過SS2基因組隨機展示文庫與豬腦微血管內皮細胞(PBMEC)和星形膠質細胞(AC)共培養(yǎng)模型互作篩選到的SS2 Eno是重要的互作分子,但尚未有關于Eno在SS2突破血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)誘發(fā)腦膜炎中作用的相關報道,為此,本研究針對Eno在SS2腦膜炎發(fā)生中的作用及機制開展了以下工作:1.為闡明SS2 Eno在SS2感染機體入侵BBB中的作用,原核表達獲得了重組蛋白Eno,建立共培養(yǎng)BBB模型,將重組Eno作用于BBB模型,模型跨內皮細胞電阻(TEER)的測定結果發(fā)現Eno可顯著增加BBB模型通透性,抗體阻斷Eno也可顯著抑制SS2對PBMEC的粘附、入侵以及對BBB的破壞作用;ICR小鼠靜脈注射Eno抗體以封閉SS2感染小鼠時Eno的作用,結果發(fā)現抗體阻斷Eno可顯著提升SS2感染ICR小鼠存活率;此外,抗體阻斷Eno可顯著抑制SS2感染小鼠腦部對EB的通透性。以上結果說明了Eno介導了SS2感染機體和對BBB的破壞。2.為探討Eno破壞BBB的作用機制,本研究通過Annexin-V/PI雙染法、Western blot(WB)等方法分析Eno刺激PBMEC的凋亡情況,結果發(fā)現:Eno可通過Caspase-8/Caspase3途徑誘導PBMEC發(fā)生凋亡,抗體阻斷Eno可顯著抑制SS2誘導的PBMEC凋亡,說明Eno在SS2誘導的細胞凋亡中占有重要作用;為探討凋亡在SS2入侵BBB中的作用,使用凋亡抑制劑抑制BBB模型上室PBMEC凋亡的發(fā)生,結果顯示抑制凋亡可顯著抑制SS2對BBB模型的穿越;除檢測凋亡外,研究通過RT-PCR、WB和免疫熒光等方法檢測了Eno作用于PBMEC后其細胞間緊密連接蛋白(Tight junction proteins,TJs)的表達情況,結果發(fā)現Eno可顯著抑制細胞間TJs ZO-1和Occludin的表達;利用穩(wěn)定表達Eno的BL21菌株(BL21-Eno)感染小鼠,并對小鼠腦部TJs的表達進行WB分析,結果發(fā)現BL21-Eno感染小鼠腦部ZO-1和Occludin表達量顯著低于BL21-23a(轉化p ET23a空載體的BL21)感染組。以上結果說明了Eno可通過誘導PBMEC凋亡和抑制細胞間ZO-1和Occludin的表達進而增加BBB的通透性。3.為找到Eno在PBMEC表面的受體,本研究通過Pull down、質譜分析、免疫共沉淀(Co-ip)等實驗,最終發(fā)現RPSA是Eno在細胞表面的互作蛋白,免疫熒光分析結果也顯示Eno與RPSA可共定位于細胞表面。4.為探討RPSA和HSPD1在Eno誘導的PBMEC凋亡和抑制TJs表達中的作用,研究首先對Eno、RPSA、HSPD1三者的關系進行分析,WB結果顯示Eno刺激細胞后RPSA和HSPD1高表達,敲低或敲除RPSA可顯著抑制Eno誘導HSPD1高表達,而敲低HSPD1卻對Eno誘導的RPSA表達無影響,表明Eno與RPSA結合誘導了HSPD1的高表達。進一步研究發(fā)現敲低(或敲除)RPSA和HSPD1可顯著抑制Eno誘導的細胞凋亡;WB分析發(fā)現敲低或敲除RPSA可以使得Eno抑制TJs的表達得到一定程度的恢復,但是敲低HSPD1對TJs的表達抑制無影響。為進一步確定Eno與RPSA結合誘導HSPD1高表達的機制,本研究對Eno刺激后胞漿蛋白和核蛋白分別進行磷酸化蛋白組學和核蛋白組學分析,并通過WB進行驗證分析,結果發(fā)現Eno與RPSA結合后胞漿p38和ERK被顯著激活,進而激活下游核轉錄因子e IF4E,最終導致HSPD1高表達。5.為了在體內驗證以上相關信號分子的表達,本研究通過攜帶sh RPSA和sh HSPD1的AAV9感染小鼠腦部,建立腦部敲降RPSA和或HSPD1模型,并對Eno注射或SS2感染后小鼠腦部各類樣本進行相關指標的分析,結果發(fā)現基因敲降RPSA和HSPD1顯著提升了SS2感染小鼠的存活率,致弱了SS2對腦部的破壞作用;免疫組化分析Eno刺激細胞活化的相關分子(RPSA、HSPD1、p38、ERK、e IF4E、Caspase-3、ZO-1、Occludin等)的表達情況,結果與體外研究結果相一致;建立SS2感染巴馬香豬的腦膜炎與非腦膜炎模型,并對以上信號分子在腦膜炎感染豬腦部的表達情況做了免疫組化分析,結果與體外研究結果一致。綜上,本研究發(fā)現Eno通過與細胞表面RPSA結合,激活下游p38/ERK-e IF4E信號,進而導致HSPD1表達和胞外分泌增加,最終引起細胞凋亡;Eno與RPSA結合可激活胞內Rho A信號,進而抑制ZO-1和Occludin的表達,導致BBB通透性增加。以上現象的發(fā)現及機制的闡明為SS2突破BBB機制的研究提供重要的理論基礎,也為腦膜炎防治提供了借鑒。
【圖文】：

要病原及豬鏈球菌 2 型腦膜炎的危害炎是世界上十大由于感染導致死亡的疾病之一，菌性病原隨血液流動擴散入腦部引發(fā)的腦膜或成中樞神經系統(tǒng)（Central Nervous system，CNS腦膜為三層膜結構（Fig 1.1），起到連接大腦和（Blood-Brain Barrier，BBB）的存在，即使細菌，但是除了很少一部分細菌外，，血液中大量的細，機體就是憑借該屏障來保護腦部組織免受損害源于血液的病原菌可以利用自身的某些獨特機制感染，這類由病原菌造成的 CNS 感染常被稱為細 BBB 的機制成為當前細菌性腦膜炎相關研究的

圖 1.2 豬鏈球菌 2 型流行情況（引自 Huong et al., 2014）Fig 1.2 Epidemiology of Streptococcus suis Type 2近年來，細菌穿越 BBB 進入 CNS 造成腦部感染的機制得到了廣泛的研究，其之所以得到全世界學者的廣泛關注的根本原因在于細菌可以通過其獨有的機制通過 BBB 造成 CNS 感染，而治療感染的抗菌藥物無法通過屏障到達治療靶部位[18]，這才是細菌性腦膜炎防治困難的關鍵所在。因而，闡明細菌突破 BBB 入侵 CNS 的機制對該病發(fā)病機制的研究和治療藥物的研制提供重要的理論基礎，對腦膜炎的防治意義重大。2 病原菌突破血腦屏障的機制細菌性腦膜炎的發(fā)生過程大致分為以下四個步驟：（1）細菌在上皮粘膜定植，某種細菌的定植受其他細菌或病毒的影響，某種細菌對其他細菌的定植可產生協(xié)
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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1 揭瑞;董佳慧;韓冬;王瑞玲;韓魏巍;杜戎;耿輝;;人源α-烯醇化酶B細胞表位鑒定及其與牙齦卟啉單胞菌烯醇化酶的交叉反應預測[J];中國免疫學雜志;2015年01期

本文編號：2640194