發(fā)布時間：2020-04-23 13:09

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病,在臨床上主要表現(xiàn)為豬的嘔吐、腹瀉和脫水,其中仔豬死亡率高達100%,嚴重威脅國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展。盡管對PED的報道已有四十多年的歷史,但有關(guān)該病的致病機制卻知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn),PEDV感染細胞后可以引起表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的磷酸化,提示病毒感染可激活EGFR。已有文獻報道EGFR在某些病毒感染中發(fā)揮重要作用,因此我們對EGFR在PEDV感染中的作用進行了解析。首先,我們運用EGFR配體EGF(Epidermal Growth Factor)特異性激活EGFR后測定其對PEDV感染的影響,結(jié)果顯示活化的EGFR提高了病毒RNA水平和病毒滴度,表明EGFR可促進病毒感染。同時,EGFR過表達實驗證實當EGFR功能增強時,病毒的感染效率增強,這提示EGFR參與PEDV感染。我們使用EGFR特異性抑制劑Erlotinib和Gefitinib進一步測定EGFR對PEDV感染的影響。間接免疫熒光檢測結(jié)果表明EGFR抑制劑顯著降低PEDV的感染效率,western blot、相對熒光定量PCR和TCID_(50)結(jié)果證明隨著抑制劑濃度升高,病毒蛋白表達水平、RNA水平和病毒滴度逐漸降低。此外,我們引入EGFR特異性siRNA,western blot結(jié)果證明EGFR內(nèi)源性表達被敲低后可以抑制病毒蛋白的合成,相對熒光定量PCR和TCID_(50)實驗結(jié)果也顯示EGFR表達量降低后病毒的RNA水平和滴度顯著降低。上述實驗結(jié)果證實在PEDV感染中,EGFR發(fā)揮重要作用。因此,我們對EGFR影響PEDV感染的分子機制進行了探索。首先,使用EGFR特異性的siRNA檢測其對IFN-I的影響。相對熒光定量PCR結(jié)果顯示敲低EGFR后IFN-I相關(guān)基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平均明顯升高,表明抑制EGFR活性可以恢復細胞抗病毒活性來抑制PEDV感染。進而我們檢測PEDV感染后EGFR下游分子STAT3的變化情況,western blot結(jié)果表明在PEDV感染中,STAT3也被磷酸化,提示病毒感染激活了EGFR及其下游分子STAT3。運用STAT3抑制劑或者STAT3特異性siRNA抑制STAT3活性或表達,相對熒光定量PCR結(jié)果顯示當抑制STAT3功能時,干擾素相關(guān)基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平明顯升高,提示抑制STAT3活性可促進干擾素產(chǎn)生。相對熒光定量PCR和western blot檢測過表達STAT3對PEDV感染的影響,結(jié)果顯示提高STAT3表達水平提高了PEDV的RNA和蛋白水平,表明STAT3的活化可促進PEDV的感染。最后,我們運用特異性siRNA敲低STAT3表達結(jié)合EGF處理激活EGFR的方法檢測EGFR介導的促進病毒感染與STAT3的相關(guān)性。Western blot結(jié)果顯示由EGFR活化引起的PEDV N蛋白增加卻因STAT3的敲低而受到抑制,表明病毒感染誘導的EGFR活化可通過其下游分子STAT3介導的信號通路來拮抗細胞的抗病毒反應。本研究首次證明EGFR在PEDV感染中的作用,闡明了一種新的PEDV逃避機體抗病毒反應的機制,可能作為PEDV感染的治療靶點。
【圖文】：

圖 1.1 PEDV 基因結(jié)構(gòu)圖(Lee C, 2015)Figure 1.1 Genome structure of PEDV圖 1.2 PEDV 結(jié)構(gòu)模式圖(Lee C, 2015)Figure 1.2 Model of PEDV structure在 PEDV 所編碼的這些蛋白中，S 基因編碼的 S 蛋白為病毒粒子表面的纖突蛋白，被認為是最重要的病毒表面抗原，在 PEDV 識別靶細胞和在細胞膜融合的過程中發(fā)揮著重要作用(Bosch B

圖 1.2 PEDV 結(jié)構(gòu)模式圖(Lee C, 2015)Figure 1.2 Model of PEDV structure些蛋白中，S 基因編碼的 S 蛋白為病毒粒在 PEDV 識別靶細胞和在細胞膜融合的過 et al., 2008)，這種相互作用能夠刺激宿主機很強的預防作用(Chang S H, et al., 2002; G, et al., 2010)。在病毒入侵細胞時，，S 蛋白內(nèi)毒力的強弱(Sato T, et al., 2011)。研究發(fā)為 COE 序列。COE 序列中任何一個氨基白除了可以用來分析其分子流行病學外，產(chǎn)中(Chen Q, et al., 2014; Gerber P F, et al.,14)。E 基因編碼的蛋白稱為 E 蛋白，也稱表面，在病毒的自我組裝以及病毒粒子的中，該蛋白的恒定表達促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生l., 2013)。M 基因編碼的 M 蛋白可以將病揮重要作用，M 蛋白和 E 蛋白相互作用可
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2637759