【摘要】：豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在豬的肌肉發(fā)育及再生過(guò)程中起到極為重要的作用。在豬肌肉生成過(guò)程中,骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為肌肉干細(xì)胞,通過(guò)激活、增殖分化形成肌管參與肌肉的發(fā)育和修復(fù)過(guò)程。已有研究表明,成肌過(guò)程中衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化受信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子及表觀(guān)修飾等一系列因素的調(diào)控。其中,表觀(guān)修飾通過(guò)改變組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的共價(jià)修飾及相應(yīng)的染色質(zhì)構(gòu)象,激活成肌特異基因的表達(dá),調(diào)控成肌祖細(xì)胞命運(yùn)及衛(wèi)星細(xì)胞不同狀態(tài)之間的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)換。目前對(duì)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化過(guò)程的表觀(guān)遺傳機(jī)制研究仍較少。因此,本研究使用新生仔豬進(jìn)行原代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離及培養(yǎng)研究。結(jié)合RNA-Seq和ChIP-Seq技術(shù)對(duì)增殖和分化的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄及三種組蛋白(H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3)和RNA聚合酶II(RNA polymorse II,RNAPII)的修飾模式進(jìn)行綜合分析,解析豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中組蛋白修飾調(diào)控基因差異表達(dá)的分子機(jī)制。主要取得了如下結(jié)果:(1)建立并優(yōu)化豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞原代分離及培養(yǎng)方法。本研究建立并比較兩種骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離方法,發(fā)現(xiàn)組織塊消化法分離豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞實(shí)驗(yàn)周期短,所獲得細(xì)胞量大。且原代分離的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖速度快,具有較強(qiáng)的肌源干細(xì)胞特性,誘導(dǎo)分化兩天即可觀(guān)察到大量明顯的肌管形成。在培養(yǎng)基中添加白血病抑制因子、GSK3β和MEK1/2抑制物能夠有效維持骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的干細(xì)胞特性,上調(diào)衛(wèi)星細(xì)胞中PAX7的表達(dá)量。(2)鑒定了原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純度、傳代能力以及轉(zhuǎn)染效率。研究表明,傳代后的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞依然能夠快速增殖,具有較強(qiáng)的肌源性分化能力。且轉(zhuǎn)染后的GFP陽(yáng)性衛(wèi)星細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為46%。此外,通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAX7陽(yáng)性的衛(wèi)星細(xì)胞純度約為93%,能夠用于后期相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。(3)鑒定了成肌相關(guān)marker基因在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式。免疫熒光結(jié)果表明,PAX7和MYOD1均在增殖期衛(wèi)星細(xì)胞中高表達(dá),而MYOG和MYOSIN僅能夠在分化的肌管中檢測(cè)到。(4)深度挖掘并分析了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞基因表達(dá)圖譜,構(gòu)建了衛(wèi)星細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中有917個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)表達(dá)基因511個(gè),下調(diào)表達(dá)基因406個(gè),主要富集在肌肉發(fā)育和細(xì)胞周期相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中,也發(fā)現(xiàn)部分組蛋白生成及染色質(zhì)重塑相關(guān)的基因在細(xì)胞分化過(guò)程中差異表達(dá)。同時(shí),5個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和9個(gè)下調(diào)表達(dá)基因的qPCR結(jié)果表明衛(wèi)星細(xì)胞中的基因表達(dá)差異與高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。(5)鑒定了三種組蛋白修飾(H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3)和轉(zhuǎn)錄因子RNAPII在全基因組范圍內(nèi)的表觀(guān)修飾模式,并檢測(cè)到組蛋白修飾在衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中修飾程度顯著下調(diào),其中H3K27me3組蛋白修飾程度降低約50%,組蛋白結(jié)合峰從22060減少至11573個(gè)。且RNAPII修飾水平在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和基因區(qū)劇烈下降,減少了3958個(gè)信號(hào)結(jié)合峰,進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式,促進(jìn)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞肌源性分化。(6)繪制了基因轉(zhuǎn)錄和表觀(guān)修飾模式圖譜,并分析基因表達(dá)與三種組蛋白修飾及RNAPII之間的聯(lián)系。H3K4me3和H3K27ac組蛋白修飾以及轉(zhuǎn)錄因子RNAPII主要標(biāo)記活性基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。而H3K27me3修飾則主要富集在染色質(zhì)抑制區(qū)域,調(diào)節(jié)179個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。(7)解釋了組蛋白修飾變化對(duì)基因差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,表明在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中,基因的上調(diào)表達(dá)伴隨著明顯的RNAPII和H3K27ac組蛋白修飾程度上升及H3K27me3組蛋白修飾降低。且H3K27me3組蛋白修飾與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖相關(guān)基因的沉默密切相關(guān)。同時(shí),H3K27me3修飾水平的降低促進(jìn)139個(gè)成肌特異基因的上調(diào)表達(dá),調(diào)控豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化。綜上所述,在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中,成肌特異轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的H3K27me3組蛋白修飾程度下降,上調(diào)包括MYOG和MEF2C等基因的表達(dá),進(jìn)一步激活下游基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞分化及肌管形成。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和組蛋白修飾模式分析豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的分子機(jī)制,為闡明組蛋白修飾調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞分化的表觀(guān)遺傳機(jī)制提供了新的線(xiàn)索。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文骨骼肌的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且有序的過(guò)程。在脊椎動(dòng)物中，，骨骼肌的胚胎發(fā)育模式相似，除了一些顱面和食道肌，大部分肌肉均發(fā)育自中胚層（mesoderm）細(xì)胞。在胚胎發(fā)育的早期階段，軸旁中胚層（paraxial mesoderm）的細(xì)胞受脊索和神經(jīng)管的信號(hào)調(diào)節(jié)，以頭至尾側(cè)的方向分化形成暫時(shí)性的體節(jié)組織（somite）（Pourquie 2001,Pownall et al. 2002）。隨后體節(jié)沿背腹軸方向分層形成背側(cè)生皮肌節(jié)和腹側(cè)生骨節(jié)。其中，背側(cè)的生皮肌節(jié)進(jìn)一步分化形成軀干和肢體骨骼肌組織，在成肌相關(guān)基因的調(diào)控下遷移至肢體相應(yīng)部位形成成肌細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成骨骼肌組織（圖 1）（Stockdale et al. 2000, Summerbell and Rigby 2000）。De Angelis 等人的相關(guān)研究表明，小鼠的骨骼肌干細(xì)胞出現(xiàn)在胚胎發(fā)育晚期，并且在出生后的肌肉生長(zhǎng)期間高度活躍，為成年個(gè)體提供肌肉干細(xì)胞來(lái)源（DeAngelis et al. 1999）。

圖 2. 骨骼肌結(jié)構(gòu)示意圖（Relaix and Zammit 2012）Figure 2. The structure of skeletal muscle.3.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖發(fā)育研究進(jìn)展近年來(lái)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活及增殖過(guò)程一直是研究熱點(diǎn)。Pax3 和 Pax7為是衛(wèi)星細(xì)胞命運(yùn)決定的主要調(diào)控因子。其中 Pax7 在成年個(gè)體的衛(wèi)星細(xì)胞中高達(dá)，而 Pax3 僅在膈肌等肌肉組織的衛(wèi)星細(xì)胞中高表達(dá)，在其他肌肉中表達(dá)水平（Soleimani et al. 2012b）。Pax3 和 Pax7 作為成肌過(guò)程的兩個(gè)上游轉(zhuǎn)錄因子，能過(guò)調(diào)控生肌調(diào)控因子（myogenic regulate factors, MRFs）的時(shí)空表達(dá)調(diào)節(jié)肌肉發(fā)程。Pax3 主要在肌肉的胚胎發(fā)育過(guò)程發(fā)揮作用，并通過(guò)結(jié)合 Myf5 的遠(yuǎn)程增強(qiáng)進(jìn)干細(xì)胞激活轉(zhuǎn)換為成肌細(xì)胞。Pax7 則在個(gè)體出生后的肌肉發(fā)育過(guò)程中起作用通過(guò)激活 MyoD 的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)（Olguin and Olwin 2004, Zammil. 2004）。研究表明敲除 Pax7 基因并不影響 Myf5 的基因轉(zhuǎn)錄，但會(huì)導(dǎo)致 MyoD
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：2637039