【摘要】：中草藥在我國(guó)具有悠久的歷史,尤其在病毒性疾病防治方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。一些中草藥及其成分不僅能直接影響病毒復(fù)制,還能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原,均可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制,引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染,從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,除了依靠疫苗免疫,探討控制PCV2和PRRSV感染的新策略十分必要。本研究從牛蒡子中提取活性成分牛蒡苷元(ACT),分析其在體內(nèi)外對(duì)PCV2和PRRSV的抗病毒活性,以期為豬圓環(huán)病毒病(PCVAD)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的防控以及ACT的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。牛蒡子粗粉經(jīng)脫脂后用含5%鹽酸的50%乙醇溶液回流5h,過(guò)濾后藥渣用50%乙醇溶液重復(fù)提取1h,合并濾液,用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性,氯仿萃取兩次,減壓旋轉(zhuǎn)蒸干后獲得ACT粗品,經(jīng)兩次硅膠柱層析純化獲得ACT;三批次提取的ACT平均百分含量為98.2%,平均提取率為1.62%。分析了 ACT對(duì)PCV2在PK-15細(xì)胞及小鼠體內(nèi)增殖的影響。結(jié)果顯示,15.6-62.5μg/mLACT能夠明顯抑制PCV2在PK-15細(xì)胞上的增殖(p0.01);進(jìn)一步小鼠試驗(yàn)顯示,按每公斤體重0.2mg腹腔注射ACT能夠明顯抑制PCV2在小鼠肺、脾及腹股溝淋巴結(jié)組織內(nèi)的增殖(p0.01)。分析了 ACT對(duì)人工感染PCV2仔豬體內(nèi)病毒增殖及組織病理學(xué)影響。結(jié)果顯示,攻毒前按劑量20μg/kg和50μg/kg連續(xù)給藥3天均能顯著抑制攻毒后7、14和21d仔豬外周血病毒載量(p0.05,p0.01);攻毒后21d將全部試驗(yàn)仔豬剖殺,發(fā)現(xiàn)給藥組1(20 μg/kg)能顯著抑制PCV2在腹股溝淋巴結(jié)(p0.05)、腸系膜淋巴結(jié)(p0.05)組織中的增殖,給藥組2(50μg/kg)還能顯著抑制PCV2在扁桃體(p0.05)和肺(p0.05)組織中的增殖;病理切片和組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示,兩個(gè)劑量ACT均能減輕PCV2感染造成的上述臟器組織的病理?yè)p傷。分析了 ACT對(duì)PRRSV體外增殖的影響。結(jié)果顯示,12.5-100μg/mL的ACT對(duì)1OOTCID50及10TCID50PRRSV均顯示出顯著的直接滅活作用(p0.01);0.39-100μg/mLACT能顯著抑制100TCID50及 10TCID50PRRSV 在 MARC-145 細(xì)胞的增殖(p0.01);而 0.19-100μg/mLACT 預(yù)處理細(xì)胞并不能影響PRRSV的感染和增殖。從細(xì)胞周期調(diào)控角度探討了 ACT抑制PCV2增殖的機(jī)理。結(jié)果顯示,62.5μg/mLACT能抑制PCV2感染導(dǎo)致的PK-15細(xì)胞S期延遲(p0.01);同時(shí)抑制CyclinE2、CDK2、p53的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。表明ACT可能通過(guò)抑制CyclinE2、CDK2、p53蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞周期分布,從而抑制PCV2在PK-15細(xì)胞的增殖。綜上,本研究建立了一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的ACT制備方法,并對(duì)ACT在體內(nèi)外抗PCV2和PRRSV感染的作用和效果進(jìn)行了研究分析。結(jié)果表明,ACT對(duì)PCV2在細(xì)胞、小鼠及仔豬的增殖均具有良好的抑制效果,在體外對(duì)PRRSV也具有一定的直接滅活和抑制作用,并發(fā)現(xiàn)ACT可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期抑制PCV2在PK-15細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘ACT抗病毒機(jī)理及臨床防控PCVAD和PRRS提供了試驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

學(xué)博士學(xué)位論文邐第三章牛蒡苷元對(duì)ＰＣＶ２在ＰＫ－１５細(xì)胞及小鼠體內(nèi)增果逡逑Ｖ２定量ＰＣＲ檢測(cè)方法的建立逡逑定純化的ＰＣＶ２卩丨丨性克隆質(zhì)粒濃度為０．２ｐｇ／ｎＬ，折算含有ｌｘＫ＾ｃｏｐｉｅｓ爾Ｌ。將化質(zhì)粒進(jìn)行１０倍梯度稀釋，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖２－１。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２為－３．９６７８９０，相關(guān)系數(shù)為０．９９６２９１，截距為５５．９０６４１４，直線方程為逡逑９０ｘ＋５５．９０６４１４，其中ｙ為循環(huán)閾值，ｘ為質(zhì)粒模板的拷貝數(shù)。逡逑［Ｊｔｌｌｉ邋Ｒｎ邋Ｃｖｃｌ？逡逑

學(xué)博士學(xué)位論文邐第三章牛蒡苷元對(duì)ＰＣＶ２在ＰＫ－１５細(xì)胞及小鼠體內(nèi)增果逡逑Ｖ２定量ＰＣＲ檢測(cè)方法的建立逡逑定純化的ＰＣＶ２卩丨丨性克隆質(zhì)粒濃度為０．２ｐｇ／ｎＬ，折算含有ｌｘＫ＾ｃｏｐｉｅｓ爾Ｌ。將化質(zhì)粒進(jìn)行１０倍梯度稀釋，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖２－１。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２為－３．９６７８９０，相關(guān)系數(shù)為０．９９６２９１，截距為５５．９０６４１４，直線方程為逡逑９０ｘ＋５５．９０６４１４，其中ｙ為循環(huán)閾值，ｘ為質(zhì)粒模板的拷貝數(shù)。逡逑［Ｊｔｌｌｉ邋Ｒｎ邋Ｃｖｃｌ？逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S853.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2634640