【摘要】：牦牛作為青藏高原地區(qū)重要經(jīng)濟物種資源,其生存環(huán)境長期受到高海拔及寒冷因素的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。牦牛是季節(jié)性發(fā)情動物,繁殖能力低下,一般是兩年一胎或者是三年兩胎。所以牦牛受精卵對于牦牛來說非常珍貴,提高受精卵的附植率是提高牦牛生殖率的重要方式。為了提高牦牛胚胎的附植率,本研究對激素-生長因子-黏附因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)在牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞上的變化進行研究。主要從以下幾個方面的試驗進行:(1)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的分離與培養(yǎng):選取牦牛子宮角后2/3段,并分離出上皮層,利用不同消化方法(胰蛋白酶消化法、Ⅰ型膠原酶消化法、兩部酶消化法)對子宮內(nèi)膜上皮細胞進行消化,利用細胞MTT測試計算細胞消化數(shù)量及消化率,評價最佳消化方法。利用差速消化法和差速貼壁法對細胞純化,并評價出最佳純化方法。結(jié)果顯示,兩部酶消化法的消化率最高,最佳消化方式為先用0.25%胰蛋白酶消化10min,再用0.25%Ⅰ型膠原酶消化3h。細胞純化試驗中發(fā)現(xiàn),差速貼壁法貼壁30min到35min得到的細胞純度最高。該試驗優(yōu)化了子宮內(nèi)膜上皮細胞的分離及純化,并且得到了高純度的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞。(2)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的鑒定與特性研究:采用純化后第三代牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞,利用細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線;利用角蛋白18、波形蛋白、PBS對細胞進行免疫組化鑒定;利用福爾根染色對細胞核DNA原位定位;利用秋水仙素法制備染色體并進行核型分析。結(jié)果顯示,細胞生長曲線類似于“S”型生長曲線,在3-6天細胞數(shù)目成對數(shù)性生長,平均生長周期為1.5-2天;角蛋白18及波形蛋白表達為陽性、PBS表達為陰性,且角蛋白18的陽性表達率超過99%,證明細胞的純度非常高;核型分析得到牦牛共30對染色體,其中有29對為長染色體,一對為性染色體。這些足以證明通過試驗一中得到的細胞為牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞。(3)不同濃度的E_2和P_4對牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌EGF和IGF-1的影響:采用純化后第三代牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞,向其中分別添加E_2和P_4兩種激素以及混合添加兩種激素,作用不同時間后,利用細胞MTT測試和Real-time PCR兩種方法檢測兩種激素對于細胞最佳誘導(dǎo)時間及EGF和IGF-1的最佳表達時間;并向其中分別添加不同濃度的E_2和P_4兩種激素以及混合添加不同濃度的兩種激素作用最佳誘導(dǎo)時間后,利用間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting以及ELISA四種方法,檢測兩種激素對子宮內(nèi)膜上皮細胞表達EGF和IGF-1的最佳誘導(dǎo)濃度。結(jié)果顯示,不同種類激素誘導(dǎo)細胞最佳生長時間以及生長因子最佳表達時間均為24h,間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting以及ELISA四種方法均證明兩種生長因子在單一激素誘導(dǎo)下表達量與激素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,但并不顯著,在兩種激素同時作用下表達量顯著上升,其中最佳表達濃度為E_210ng/mL和P_410ng/mL。本試驗發(fā)現(xiàn)孕酮和雌二醇聯(lián)合作用時會有效提高子宮內(nèi)膜上皮細胞EGF和IGF-1的表達量。(4)不同濃度的EGF和IGF-1對牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌MUC1和PGF的影響:采用純化后第三代牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞,向其中分別添加EGF和IGF-1及其各自受體抑制劑作用不同時間,利用細胞MTT測試和Real-time PCR兩種方法檢測兩種生長因子對細胞最佳誘導(dǎo)生長時間及MUC1和PGF的最佳表達時間;向其中分別添加不同濃度的EGF和IGF-1及各自受體抑制劑作用最佳表達時間,利用間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting三種方法,檢測EGF和IGF-1對子宮內(nèi)膜上皮細胞表達MUC1和PGF的最佳誘導(dǎo)濃度。結(jié)果表明,細胞最佳生長時間以及黏附因子最佳表達時間均為24h,間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting三種方法均證明MUC1表達量與EGF和IGF-1的濃度呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系,在濃度為100ng/mL時表達量最低,與生長因子受體抑制劑濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,最佳濃度為40μΜ/mL;PGF表達量與EGF和IGF-1的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,最佳濃度為100ng/mL,與兩種生長因子受體抑制劑濃度呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系,在40μΜ/mL時表達量最低。本試驗發(fā)現(xiàn),生長因子可以抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞上MUC1的表達但是可以促進PGF的表達。本試驗從分離純化培養(yǎng)的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞上對激素-生長因子-黏附因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)進行研究,并闡明E_2及P_4與EGF和IGF-1與MUC1和PGF之間的表達量誘導(dǎo)關(guān)系。具體結(jié)論如下:1、牦牛子宮內(nèi)膜上皮最佳消化方法是兩步酶消化法,先用0.25%胰蛋白酶消化10min,再用0.25%Ⅰ型膠原酶消化3h。最佳純化方法是差速貼壁法貼壁30min。2、通過免疫組化、福爾根染色和核型分析法證明消化純化得到的細胞是牦牛子宮內(nèi)膜上皮細胞,并繪制該細胞生長曲線。3、單獨使用E_2和P_4都能促進EGF和IGF-1表達,聯(lián)合使用E_2和P_4時,EGF和IGF-1的表達量顯著升高,其中最佳作用濃度E_2為10ng/mL和P_4為10ng/mL聯(lián)合作用。4、EGF和IGF-1都抑制MUC1的表達,最佳抑制濃度為100ng/mL。其受體抑制劑Gefitinib和BMS-536924都能促進MUC1的表達,最佳促進濃度為40μM/mL。EGF和IGF-1都能促進PGF的表達,最佳促進濃度為100ng/mL。其受體抑制劑Gefitinib和BMS-536924都能抑制PGF的表達,最佳抑制濃度為40μM/mL。
【圖文】：

5圖 1：未附植前胚胎的結(jié)構(gòu)Fig.1. The structure of the pre-implantation embryo也是整個胚胎中最核心的部分。受精卵攜帶了來自于父體的單染色體，通過多次二分裂，是由最初的單細胞發(fā)展為了多細胞胞團就是這些細胞的遺傳物質(zhì)。這些內(nèi)細胞團中的細胞，在發(fā)來的營養(yǎng)物質(zhì)進一步進行分化，從而形成了胎兒的各個不同功為胚胎的內(nèi)胚層[36]；②是透明帶：透明帶并不是受精卵時細胞形成桑椹胚后，逐漸出現(xiàn)的一個結(jié)構(gòu)，主要起到的作用時保護狀的物質(zhì)，但并不是有磷脂雙分子層所組成的，能夠不阻礙細有效的低檔有害物質(zhì)對胚胎的侵害，在胚胎附植的過程中會脫]；③是滋養(yǎng)層細胞：哺乳動物圍繞胚泡形成的胚外層上皮。將織共同組成胎盤。滋養(yǎng)層是胚胎進行附植的最重要的一個結(jié)構(gòu)與子宮內(nèi)膜上皮之間發(fā)生了緊密的聯(lián)合，從而使得胚胎發(fā)生附著胚胎的發(fā)育，成為了包裹胚胎外胚層的上皮[38]；④是囊胚腔后，細胞繼續(xù)分裂，到達桑椹胚，但是在這一過程中，，細胞向

體[44]。這一過程如圖 2 所示，最后能夠獲得圖 2B 中的精子，即為具有受精能子[45]。在精子的形狀中，精子尾巴主要為了能夠在雌性體內(nèi)更加快速的運動更有利于精子的運動發(fā)生，其中頂體主要是保護精子中的遺傳物質(zhì)，并且也是卵子的重要結(jié)構(gòu)[46]。AB
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823.85

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3 徐U

本文編號：2633569