發(fā)布時間：2020-04-18 13:11

【摘要】：miRNAs是在真核生物中被發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的單鏈非編碼小RNA,其長度18-25nt左右,miRNA在不同物種間具有嚴(yán)格的保守性,具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的作用,能夠參與多種生命活動,包括有機(jī)體的發(fā)育過程,機(jī)體的免疫過程,甚至能夠參與到腫瘤癌癥的發(fā)生和成熟脂肪細(xì)胞的形成等過程。成熟脂肪細(xì)胞的形成是一個極其復(fù)雜的生物過程,涉及到諸多因素的調(diào)控作用。成熟脂肪細(xì)胞的形成過程主要包括三個主要的階段,包括間充質(zhì)干細(xì)胞形成前體脂肪細(xì)胞,前體脂肪細(xì)胞生長增殖以及前體脂肪細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞,這其中后兩個階段是成熟脂肪細(xì)胞形成的重要部分。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果以及閱讀相關(guān)的文獻(xiàn),選取了差異表達(dá)的miR-331-3p進(jìn)行更深入研究。并通過相關(guān)實(shí)驗證明了miR-331-3p參與到豬的前體脂肪細(xì)胞增殖、分化與脂肪酸代謝過程中。主要研究結(jié)果如下:1、過表達(dá)miR-331-3p后,通過CCK8試劑分析細(xì)胞生長狀況檢測,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長速度減慢,并且流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果處于G0/G1期細(xì)胞比例上升,S期細(xì)胞比例下降也與CCK8實(shí)驗結(jié)果相符合。過表達(dá)miR-331-3p后,利用qRT-PCR檢測了細(xì)胞周期相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)的基因mRNA水平均顯著降低,而抑制細(xì)胞增殖的相關(guān)基因的mRNA水平顯著升高。結(jié)果表明miR-331-3p具有抑制豬前體脂肪細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。2、過表達(dá)miR-331-3p后,將前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化并通過qRT-PCR的方法檢測miR-331-3p在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)趨勢以及檢測其分化過程中前體脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)miR-331-3p具有促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化的作用。3、利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測到了和脂肪酸代謝相關(guān)的基因DLST和SLC25A1基因,通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)熒光素酶表達(dá)量的變化驗證了DLST為miR-331-3p的靶基因,并且過表達(dá)miR-331-3p能夠顯著降低DLST mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。DLST基因編碼的酶存在于檸檬酸丙酮酸循環(huán)通路中,這條通路能夠?qū)⒓?xì)胞合成脂肪酸的所必需的乙酰-COA從線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)DLST、SLC25A1基因以及其通路上下游基因特別是其中ACLY和FAS基因的熒光定量結(jié)果,過表達(dá)miR-331-3p后脂肪酸合成增加。油紅O染色以及脂滴的定量均表明過表達(dá)miR-331-3p后脂肪酸合成增加,轉(zhuǎn)染inhibitor效果均相反,也證明了miR-331-3p可以通過檸檬酸丙酮酸循環(huán)通路促進(jìn)脂肪酸的合成。綜上所述,本研究系統(tǒng)的分析了miR-331-3p對于前體脂肪細(xì)胞增殖分化與脂肪酸累積的調(diào)控,最終證明了miR-331-3p能夠抑制前體脂肪細(xì)胞增殖,促進(jìn)其分化成為成熟脂肪細(xì)胞以及能夠促進(jìn)脂肪酸積累。
【圖文】：

組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

1-3p 對豬前體脂肪細(xì)胞增殖、分化與脂肪酸積累的調(diào)控28圖3-2 背最長肌和背膘中miR-331-3p的qPCR結(jié)果.Figure 3-2 qPCR result of the expression level of miR-331-3p in muscle and backfat.3.2 miR-331-3p 調(diào)控的靶基因驗證3.2.1 miR-331-3p 的靶基因預(yù)測采用靶基因在線預(yù)測軟件 Targetscan：（http ://www.targetscan.org/.）、miRanda：（ http://www.microrna.org/microrna/home.do ） 和 miRWalk (http://zmf.umm.uni -heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/) 預(yù)測 miR-331-3p 的靶基因為 二氫硫辛酰胺 S-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶 (dihydrolipoamideS-succinyltransferase，DLST) 和溶質(zhì)載體家族 25 成員 1(solutecarrier family 25 member 1，SLC25A1)。發(fā)現(xiàn) DLST 和 SLC25A1 基因的 3’UTR 區(qū)域均存在這 miR-331-3p 種子序列的互補(bǔ)區(qū)域，，并且該區(qū)域在物種之間保守 (見圖 3-3)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2632126