本文關鍵詞：鵝細小病毒結構蛋白真核表達質粒的構建及免疫原性初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的雛鵝急性敗血性傳染病。病鵝的臨診特點是精神委頓、食欲廢絕、嚴重下痢、有時會出現(xiàn)神經癥狀。當前尚無治療該病的特效藥物,主要通過對開產前種鵝與雛鵝使用傳統(tǒng)疫苗及高免血清進行預防。我國是全世界最大的水禽養(yǎng)殖國家,隨著人民生活水平不斷提高,對禽類肉蛋的需求不斷增加,加上本病傳播快、感染性強、致死率高、每年都有不同程度的流行,嚴重危害了養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展,這要求我們應該深入了解該病毒的分子生物學特征及致病機制。本研究的主要內容有以下幾點：1.將GPV的三個衣殼蛋白分別連接到真核表達載體上,構建出pcDNA3.1-VP1、 pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP3重組質粒,以脂質體轉染法將這三種質粒分別轉染到哺乳動物細胞系和原代鵝胚成纖維細胞系(Goose embryo fibroblast, GEF),采用western blot的方法檢測目的蛋白的表達情況。結果顯示,重組VP1、VP2和VP3蛋白能分別與抗his標簽抗體和抗GPV多抗血清在蛋白分子質量標準80 kDa、70 kDa和60 kDa附近發(fā)生特異性結合。說明這三種重組質粒能在同源及異源細胞中有效表達,為后續(xù)實驗奠定了基礎。2.利用GEF和鵝外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)為模型比較三種衣殼蛋白的細胞免疫原性。本研究將VPs的三種重組質粒轉染GEF,60 h后收獲細胞并提取總RNA,以實時熒光定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR)的方法檢測IL-6和IL-1β、FNs的轉錄水平�；诖�,將GEF表達的VPs用于處理PBMCs,共孵育6 h,收集細胞抽提RNA檢測CD4、CD8α、IL-6、IL-1β和IFNs的表達情況。還將GEF中表達的VP2經超離純化、磷鎢酸負染色后在透射電鏡下觀察。結果發(fā)現(xiàn),VP2和VP3在GEF和PBMCs中都可顯著上調IL-6和IL-1β的mRNA表達量。在PBMCs模型中,VP1誘導產生的細胞因子與實驗對照相比無明顯差異；而VP2還可顯著上調IFNγ和IFNλ的量；VP3處理組的CD8α表達量顯著高于VP1和VP2處理組。以上結果說明VP2和VP3的細胞免疫原性要優(yōu)于VP1,且VP2在GEF中表達可形成病毒樣顆粒。3.基于我們前期研究結果,VP2被挑選出作為DNA疫苗候選基因,再聯(lián)合不同佐劑共同以肌肉途徑免疫雛鵝,分別在免疫0d、7d、14d、21 d、28 d的時間點采集血液樣品,采用RT-PCR和間接ELISA的方法分別檢測被免疫雛鵝血液中CD4、 CD8α、IL-1β、IL-18、IFNs等細胞因子的轉錄水平變化,以及血清中特異性GPV IgY抗體水平,最后對幾種免疫佐劑的免疫效果進行比較分析。結果顯示,在免疫后的28 d內,CD4和CD8a的表達水平整體呈上升趨勢；在免疫后第7d和第14 d,pcDNA3.1-VP2免疫組鵝血液中CD8a的表達水平顯著上升；pcDNA3.1-VP2組也在第7d顯著上調了IFNλ的表達；此外,pcDNA3.1-VP2與ODN2006佐劑聯(lián)合免疫組分別在第7d和第21d顯著上調了IL-1β和IL-18的表達。血清中特異性IgY抗體檢測結果顯示：除對照組外的三組實驗組在免疫后14 d開始抗體增加,并隨著時間增加而升高,至28 d時,抗體水平達到最高；pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP2+MPLA、 pcDNA3.1-VP2+ODN2006免疫組的抗體水平均顯著高于陰性對照組,但是不同佐劑組之間無差異。此外,在第21 d時pcDNA3.1-VP2免疫組的抗體水平顯著高于陰性對照組。
【關鍵詞】：鵝細小病毒 VPs 細胞因子 佐劑 體液免疫
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-10
• 第一章 文獻綜述10-18
• 1 鵝細小病毒概述10-15
• 1.1 鵝細小病毒的發(fā)現(xiàn)及歸類10-11
• 1.2 鵝細小病毒的特征11-12
• 1.3 鵝細小病毒基因組及其編碼的蛋白12-15
• 2 禽類基因疫苗研究進展15-17
• 2.1 禽類基因疫苗15-16
• 2.2 佐劑的應用16-17
• 3 本研究的目的與意義17-18
• 第二章 鵝細小病毒衣殼蛋白VP1、VP2和VP3真核表達載體的構建及表達18-40
• 1 實驗材料18-20
• 1.1 實驗動物18
• 1.2 毒株,菌種和質粒18
• 1.3 實驗儀器18-19
• 1.4 實驗試劑及相關溶液配制19-20
• 2 實驗方法20-30
• 2.1 GPV VP1/VP2/VP3目的片段的擴增20-23
• 2.2 重組表達質粒的構建23-26
• 2.3 GPV的鼠多克隆抗體制備26-27
• 2.4 pcDNA3.1-VP1,pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP3在細胞中的表達及驗證27-30
• 3 實驗結果30-37
• 3.1 目的基因的擴增30-32
• 3.2 重組表達質粒的構建32-34
• 3.3 重組質粒在293T細胞中的表達34-35
• 3.4 重組質粒在鵝胚成纖維細胞中的表達35-37
• 4 討論37-39
• 4.1 重組質粒的構建策略37
• 4.2 細胞的培養(yǎng)37-38
• 4.3 細胞轉染38-39
• 5 小結39-40
• 第三章 VPs在不同細胞模型中誘導的免疫應答比較40-50
• 1 實驗材料40-41
• 1.1 實驗動物40
• 1.2 實驗儀器40-41
• 1.3 實驗試劑41
• 2 實驗方法41-45
• 2.1 pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP3和pcDNA3.1轉染鵝胚成纖維細胞的免疫應答檢測41-43
• 2.2 VPs處理鵝外周血單核細胞的免疫應答檢測43-44
• 2.3 VP2病毒樣顆粒的純化與鑒定44-45
• 3 結果45-48
• 3.1 pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP3和pcDNA3.1轉染鵝胚成纖維細胞的免疫應答檢測45-46
• 3.2 VPs處理鵝外周血單核細胞的免疫應答檢測46-48
• 3.3 VP2病毒樣顆粒的電鏡觀察48
• 4 討論48-49
• 5 小結49-50
• 第四章 MPLA和ODN2006作為VP2基因疫苗佐劑誘導的免疫應答50-59
• 1 實驗材料50-51
• 1.1 實驗動物50-51
• 1.2 實驗儀器51
• 1.3 實驗試劑51
• 2 試驗方法51-54
• 2.1 基因疫苗的大量制備51
• 2.2 實驗動物的分組及免疫51-52
• 2.3 血樣的采集和處理52
• 2.4 鵝血液細胞因子變化量檢測52-53
• 2.5 特異性GPV血清IgY抗體的間接ELISA測定53-54
• 3 結果54-57
• 3.1 鵝血液細胞因子變化量檢測54-56
• 3.2 特異性GPV血清IgY抗體的變化56-57
• 4 討論57-58
• 4.1 雛鵝免疫后血液細胞因子的轉錄水平變化57
• 4.2 雛鵝免疫后血清IgY抗體的變化57-58
• 5 小結58-59
• 參考文獻59-64
• 致謝64-65
• 作者簡介及論文發(fā)表情況65

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