【摘要】：褪黑素作為多功能生物因子,具有多樣的調(diào)節(jié)作用,包括抗氧化、抗炎以及參與免疫調(diào)節(jié)等,但是關(guān)于褪黑素是否通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對炎癥起作用卻未知。本試驗通過使用衣霉素處理建立3T3-L1脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型誘導炎癥,再用褪黑素,分別檢測了其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與炎癥不同方面的影響以及作用機制,共獲以下結(jié)果:1.褪黑素通過上調(diào)生物節(jié)律從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。使用1μmol/L褪黑素(Melatonin,MT)處理成熟的脂肪細胞24h之后,檢測發(fā)現(xiàn)生物鐘基因CLOCK和BMAL1的mRNA表達顯著增加(P0.05)、PER1、PER2、CRY1、CRY2和REV-ERB的mRNA表達顯著減少(P0.05),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥相關(guān)基因表達也發(fā)生了顯著的下降;用鈣離子探針對脂肪細胞染色后發(fā)現(xiàn),褪黑素處理顯著減少鈣離子熒光強度從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;通過檢測PER1在MT處理前后的DNA甲基化水平顯示,褪黑素通過下調(diào)生物鐘基因PER1的DNA甲基化促進生物節(jié)律,其中甲基化結(jié)合蛋白3(Methyl-CpG-binding domain 3,MBD3)的減少最顯著;進一步在細胞中干擾PER1后發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)鍵通路分子ATF6的mRNA水平顯著增加(P0.05),使用生物信息學預測發(fā)現(xiàn)ATF6啟動子區(qū)有兩個位點可以與PER1的E-box位點相結(jié)合,通過熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)干擾PER1基因可以顯著增加兩個E-box位點的相對熒光活性(P0.05),說明PER1通過負轉(zhuǎn)錄調(diào)控ATF6緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。2.褪黑素減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的炎癥反應。為了檢測褪黑素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導炎癥的現(xiàn)象作用,使用2 ug/mL的衣霉素(tunicamycin,TM)處理細胞12h構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的模型,再用褪黑素處理,檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志因子ATF6、PERK、IRE1、GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P0.05),炎癥相關(guān)基因IL-6、TNF-α、NF-κB、NLRP3、IL-1β的mRNA和蛋白表達也顯著增加(P0.05),說明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激成功誘導炎癥的發(fā)生,而MT處理可以緩解這種作用;此外,使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)處理,發(fā)現(xiàn)當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被抑制時,炎癥相關(guān)基因表達顯著下調(diào)。又通過活體注射20 mg/kg的褪黑素和1μg/g衣霉素,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥相關(guān)基因在脂肪組織中的表達發(fā)現(xiàn)與細胞水平一致,并且通過對脂肪組織切片進行HE染色,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下,炎性浸潤現(xiàn)象明顯,且ATF6的免疫組化水平顯著增加,IL-6、TNF-α、GRP78和ATF6的免疫熒光強度也顯著升高,而MT可以抑制這種作用,以上說明MT可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的炎癥反應。3.褪黑素減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導M1型巨噬細胞極化介導炎癥反應。脂肪細胞炎癥與巨噬細胞之間的作用聯(lián)系密切,本實驗使用脂肪細胞與巨噬細胞共培養(yǎng),分別使用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)誘導M1和M2型巨噬細胞的成熟,脂肪細胞中超表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)鍵通路因子ATF6,通過檢測M1型巨噬細胞標志基因IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12以及M2型巨噬細胞標志基因CD163、CD206、IL-10和IL-4的mRNA及蛋白表達,發(fā)現(xiàn)脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下M1型巨噬細胞表面標志基因表達顯著上調(diào),M2型巨噬細胞表面標志基因表達顯著下降;對IFN-γ和CD163的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以促進IFN-γ的熒光強度,減弱CD163的熒光表達,而在添加了褪黑素之后,這些現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。此外,發(fā)現(xiàn)超表達ATF6后,炎性小體相關(guān)基因NLRP3、Pro-caspase1、Caspase1、Pro-IL-1β和IL-1β的mRNA及蛋白水平也發(fā)生了顯著的上調(diào)(P0.05),使用MT處理之后,作用相反,說明脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以通過激活炎性小體表達促進炎癥,而MT可以減輕這種作用。以上結(jié)果說明了褪黑素緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的炎癥反應。綜上所述,本試驗明確了褪黑素在脂肪細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥中的調(diào)控作用,即褪黑素通過增加生物鐘基因節(jié)律表達抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的炎癥反應,并且發(fā)現(xiàn)DNA甲基化、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及巨噬細胞極化等機制參與其中。本研究為治療脂肪細胞炎癥反應提供了新的靶點,為研究動物脂肪沉積的遺傳調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 生物鐘的等級組織（A.A.Kondratova.et al.2013）1 A hierarchical organization of the circadian clock（A.A.Kondratova.et因的表達在 SCN 之外的不同腦結(jié)構(gòu)中有節(jié)律地振蕩，表明研究表明，這些時鐘的同步活動對許多心理過程至關(guān)重要，對認知功能產(chǎn)生負面影響(Reddy et al.2010; Wulff et al.2010公認的，最近的研究表明，時鐘也涉及情緒調(diào)節(jié)，記憶和對 al.2006)。因的調(diào)節(jié)機制的機制涉及基因表達，蛋白質(zhì)修飾和分泌的晝夜節(jié)律振蕩，產(chǎn)物所控制 (Ko et al.2006)。在單個或多個時鐘基因已經(jīng)被的實驗揭示了對運動，行為，生理學和基因表達中的晝夜節(jié)物鐘基因及其產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)中連接起來(Sheram.2007)，在鐘基因產(chǎn)物中，存在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 BMAL1、CLO節(jié)因子 CRY1、CRY2、PER1、PER2 和 Rev-Erb-α，其中，BMA可以特異性的與染色質(zhì)相互作用并對其進行修飾，，從而上調(diào)

基本的螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH) 蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子，可以是制因子，它們具有高度堿性的區(qū)域以及螺旋-環(huán)-螺旋形態(tài)，bHLH 蛋結(jié)構(gòu)域與其他 bHLH 蛋白形成同二聚體或異二聚體，從而使得它們的識別 E-box 序列的 DNA-結(jié)合基序。它們通過結(jié)合基因啟動子區(qū)中的從而激活 PER1、PER2 以及 CRY1 和 CRY2 基因的轉(zhuǎn)錄。PER / CRY斷 BMAL1 / CLOCK 活性來抑制其自身基因的轉(zhuǎn)錄 (X.Gu et al.2012)-BMAL1 復 合 物 介 導 的 晝 夜 節(jié) 律 輸 出 并 且 誘 導 其 他 轉(zhuǎn) 錄 因 子ffield et al.2002;K.Oishi et al.2003; A.Grechez et al.2004)。第二個反饋環(huán)體 RORa 和 REV-erba 的轉(zhuǎn)錄組成的 (P.L.Lowrey et al.2004; S.M.R，該轉(zhuǎn)錄過程在白天由 CLOCK / BMAL1 復合物激活，隨后它們通過中的 Rev-erba / RORa 應答元件對 BMAL1 基因施加正向和負向rey et al.2004; S.M.Reppert et al.2002)。晝夜節(jié)律系統(tǒng)通過時鐘控制的周期基因影響其他生理過程(X Yang et al.2010;I.Schmutz et al.201S.Gery et al.2006)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.3

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本文編號：2627824