【摘要】：肝缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury IRI)是臨床上亟待解決的問題。近年研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress ERS)在肝缺血再灌注中有著重要作用。對ERS反應途徑的干預可能為肝臟IRI提供新的保護手段。富氫生理鹽水(Hydrogen-rich saline HRS)具有抗氧化,抗炎,抗凋亡的作用,對各種器官IRI具有廣泛的保護作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),HRS能夠通過抑制ERS,減輕肝IRI,然而其機制尚不明確,而HRS對于腹腔鏡技術(shù)建立的小型豬肝臟缺血再灌注合并肝部分切除模型中ERS影響的研究尚未見報道。本研究采用腹腔鏡手術(shù)建立小型豬肝臟缺血再灌注合并肝部分切除模型,并應用HRS干預,通過跟蹤檢測干預后肝臟組織學和ERS相關(guān)指標的變化,深入探討了HRS對肝臟缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)后ERS的影響。本實驗選取18頭健康小型豬,隨機分為三組,分別為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(IRI組)和HRS干預組(HRS組)(n=6)。Sham組僅進行翻動肝葉,維持氣腹三小時,IRI組用腹腔鏡手術(shù)建立右半肝缺血60 min合并左半肝切除模型,HRS組建立手術(shù)模型并門靜脈置管,于再灌注前10 min、再灌注6 h、術(shù)后1 d、2 d、3 d經(jīng)門靜脈注射HRS(10 mL/kg)。各組分別于術(shù)前,再灌注即刻,術(shù)后即刻,術(shù)后1 d,術(shù)后3 d經(jīng)腹腔鏡手術(shù)采取肝臟組織,進行HE染色和電鏡檢測,并采用實時熒光定量PCR、免疫組化、Western blot等方法檢測肝中ERS參數(shù)變化情況,具體檢查指標包括:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白核心蛋白(GRP78),未折疊蛋白反應(Unfolded protein reaction UPR)信號分子(PERK、IRE1、ATF6、XBP1s、p-eIF2α),ERS凋亡相關(guān)蛋白(ATF4、CHOP、p-JNK)。為研究HRS對肝損傷的保護作用,我們對肝組織病理損傷變化進行了檢測:HE染色顯示,與Sham組相比IRI組各時間點觀察到不同程度肝組織損傷:肝細胞索狀排列被破壞,細胞腫脹,空泡變性,并存在有壞死性病變和炎癥細胞浸潤。與IRI組比較,HRS組各時間點的肝細胞基本呈索狀排列,且HRS組中肝細胞壞死和炎癥浸潤顯著減少;術(shù)后1 d電鏡結(jié)果顯示Sham組肝細胞微觀結(jié)構(gòu)正常;IRI組肝細胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,結(jié)構(gòu)被破壞,糖原減少;HRS組肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心蛋白,為研究HRS對ERS的影響,我們檢測了肝組織內(nèi)GRP78表達水平變化:IRI組GRP78 mRNA表達水平分別于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d顯著高于Sham組(P0.01),于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d顯著高于HRS組(P0.01)。IRI組除術(shù)前外各時間點GRP78蛋白表達水平均顯著高于Sham組(P0.01);HRS組GRP78蛋白表達水平分別于再灌注即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d顯著低于IRI組(P0.01)。為進一步探究HRS對ERS影響的機制,我們對UPR信號分子mRNA和蛋白表達進行了檢測:IRI組PERK、IRE1、ATF6 mRNA表達水平分別于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d顯著高于Sham組以及HRS組(P0.05或P0.01);IRI組PERK、IRE1、ATF6蛋白表達水平于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d顯著高于Sham組,于術(shù)后1 d顯著高于HRS組(P0.05或P0.01)。ERS最終結(jié)果將導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的產(chǎn)生,為此我們對ERS凋亡相關(guān)蛋白進行了檢測:IRI組ATF4,CHOP,p-JNK蛋白表達水平于術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d均顯著高于Sham組,于術(shù)后即刻、術(shù)后1 d均顯著高于HRS組(P0.05或P0.01)。綜上所述:(1)HRS顯著改善肝缺血再灌注合并肝部分切除后的肝臟病理組織損傷,改善肝細胞超微結(jié)構(gòu)。表明了HRS對肝損傷具有保護作用。(2)HRS能夠抑制肝損傷導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心蛋白的上調(diào),抑制UPR三條信號通路,進而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白的表達。表明RHS能夠抑制肝損傷中的ERS。
【圖文】：

圖 2-1 腹腔鏡手術(shù)通路Figure 2-1 Operation pathway肝周圍韌帶，使肝葉充分游離。用左彎分離鉗將膽帶從膽囊管底部穿過，然后再從右內(nèi)葉基部穿過；過；同時收緊兩止血帶，用雙孔卡扣固定，將右半至圖 2-5。

圖 2-1 腹腔鏡手術(shù)通路Figure 2-1 Operation pathway2.2.4.3 右半肝缺血使用電凝裝置離斷肝周圍韌帶，使肝葉充分游離。用左彎分離鉗將膽囊管與肝實質(zhì)分離，然后將一根自制的止血帶從膽囊管底部穿過，然后再從右內(nèi)葉基部穿過；然后將另一根帶針止血帶從右外葉基部穿過；同時收緊兩止血帶，用雙孔卡扣固定，將右半肝入肝血流阻斷。缺血 60 min。如圖 2-2 至圖 2-5。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S857.146

【參考文獻】

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本文編號：2626006