【摘要】：鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipesifer,RA)是主要侵害鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種接觸性傳染病。本病在世界各地廣泛分布,具有較高的發(fā)病率和死亡率,是當前嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。隨著對細菌毒力因子的深入研究,細菌分泌系統(tǒng)在細菌致病性相關研究中發(fā)揮著重要作用。近年來,隨著Ⅸ分泌系統(tǒng)(T9SS),又稱為Por分泌系統(tǒng)在擬桿菌門成員中的發(fā)現(xiàn),在GenBank上已公布的全基因組序列的鴨疫里默氏桿菌基因組中均存在完整的T9SS核心組分,研究該分泌系統(tǒng)在細菌與宿主的相互作用以及細菌的致病過程中的作用就尤為值得關注。本研究構建獲得鴨疫里默氏桿菌Yb2株Ⅸ型分泌系統(tǒng)核心組分gldL的基因缺失株以及gldL-gldN基因雙缺失株,并對缺失株進行了生物學特性分析。此外采用2-D蛋白質組合Westerm Blot等方法對Yb2株培養(yǎng)上清中具有免疫原性的蛋白進行了鑒定。1.鴨疫里默氏桿菌Yb2株gldL和gldL-gldN基因缺失株的構建及其生物學特性研究本研究通過擴增gldL基因左、右同源臂連入自殺質粒313,通過結合轉導的方法導入鴨疫里默氏桿菌野生株Yb2,構建獲得gldL基因缺失突變株Yb2△gldL;通過結合轉導的方法導入鴨疫里默氏桿菌Yb2△gldN基因缺失突變株,構建獲得gldL-gldN基因雙缺失突變株Yb2△gldL-gldN。然后將野生株Yb2的gldL基因ORF與構建的大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭表達質粒pRES1相連接,通過接合轉導的方法將重組質粒pRES1-gldL導入缺失株Yb2△gldL中,獲得回復株cYb2△gldL。生物學特性分析的結果表明,與野生株Yb2相比,缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回復株cYb2△gldL的生長曲線無顯著性差異;另外通過蛋白酶水解試驗表明:缺失株Yb2△gldL和Yb2△gldL-gldN在含有脫脂乳的TSA平板上培養(yǎng)24h后無蛋白酶水解能力,通過雛鴨致病性分析以動物實驗LD50的測定結果顯示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN與野生株Yb2相比對雛鴨的LD50分別升高了 48、110倍左右;通過肝臟、腦、血液細菌載量的測定結果顯示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回復株cYb2△gldL感染雛鴨體內肝臟、腦的細菌載量均比野生株Yb2顯著性降低,表明缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN對組織的侵襲力下降。因此,以上結果證實gldL和gldL-gldN基因的缺失使Ⅸ型分泌系統(tǒng)的功能受損,從而使鴨疫里默氏桿菌對雛鴨的致病性降低。2.鴨疫里默氏桿菌Yb2株培養(yǎng)上清中免疫原性蛋白的鑒定采用TCA沉淀法在Yb2株上清液中加入10%的TCA,在酸性條件下從培養(yǎng)上清中鑒定到了 12種鴨疫里默氏桿菌Yb2株培養(yǎng)上清中具有免疫原性的蛋白。原核表達了 3種具有免疫原性的蛋白P1、P2和P3,經(jīng)免疫雛鴨后攻毒試驗,結果表明:P1蛋白對雛鴨抵御鴨疫里默氏桿菌感染具有一定的免疫保護性。為本研究鴨疫里默氏菌病新型疫苗的研制打下了基礎。
【圖文】：

系統(tǒng)主要包括以下１３個編碼成分基因：Ｓｏｖ、ＰｏｒＫ、ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＮ、ＰｏｒＰ、ＰｏｒＱ、ＰｏｒＴ、逡逑ＰｏｒＵ、ＰｏｒＶ、ＰｏｒＷ、ＰｏｒＸ、ＰｏｒＹ，其中一些蛋白是通過雙組分系統(tǒng)ｐｏｒＸＹ表達的［４４］。結逡逑構模式圖（如圖１所示），其中細菌的內膜部分有ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＫ，而外膜部分有ＰｏｒＮ、逡逑ＰｏｒＰ、ＰｏｒＺ，ＰｏｒＵ編碼的是一種Ｃ端肽酶，牙齦卟啉單胞菌Ｔ９ＳＳ分泌的蛋白絕大多數(shù)含逡逑有氨基酸殘基，，數(shù)量一般保持在７０－８０個Ｃ端結構域ＣＴＤ，當?shù)鞍淄ㄟ^Ｔ９ＳＳ時是蛋白分逡逑泌所必需的結構域；ＰｏｒＵ進行切割，Ｃ端暴露于細胞外環(huán)境參與蛋白功能；ＰｏｒＸ、ＰｏｒＹ逡逑分別是反應調節(jié)器和傳感器激酶，當其缺失后Ｓｏｖ、ＰｏｒＫ、ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＮ、ＰｏｒＰ、ＰｏｒＴ逡逑表達量顯著下調［４５４７］。ＰｏｒＺ是近兩年才鑒定到的Ｔ９ＳＳ核心組分，它是ＰｏｒＵ定位于細菌逡逑表面及Ｔ９ＳＳ運載蛋白的翻譯后修飾所必需的［４８］。逡逑

＝卜■：邋ｊ逡逑Ｉ：：＇，逡逑圖１－２質粒３１３－ｇＷＺ－ＬＲ的酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋３＼３－ｇＩｃ／Ｌ－ＬＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ分子標準量ＤＬ１００００邐１．重組質粒３１３－ｇＷＺ－ＬＲ的酶切結果逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ１００００邐１．邋Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋３１３－ｇＷＩ－ＬＲ邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋ＢａｍＨＩ／ｓｐｈＩ逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡積清;;一起雛鵝感染鴨疫里默氏桿菌病的診斷與防治[J];當代畜牧;2018年20期

2 張相奎;楊慶磊;向華莉;;鴨疫里默氏桿菌病的防治研究進展[J];獸醫(yī)導刊;2019年09期

3 黃海蓮;潘明輝;李烈東;馬先合;盧景華;黃沖;;一例鴨疫里默氏桿菌病的診斷報告[J];廣西畜牧獸醫(yī);2019年04期

4 楊金生;李琳;劉云志;宮江;;鴨疫里默氏桿菌病的診斷與防治[J];農村新技術;2018年04期

5 許雪玲;張海文;王學梅;吳科榜;管慶豐;;預防鴨疫里默氏桿菌病的技術措施[J];養(yǎng)禽與禽病防治;2017年11期

6 任曉梅;王小蘭;韓文龍;張雪梅;陳宗超;李濤;丁鏟;于圣青;;鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定與生物學特性研究[J];中國動物傳染病學報;2018年04期

7 許其華;李艷;;鴨疫里默氏桿菌病的診治[J];家禽科學;2016年12期

8 汪志錚;;鴨疫里默氏桿菌病的防治[J];貴州畜牧獸醫(yī);2016年06期

9 李迎曉;;鴨疫里默氏桿菌病和棘口吸蟲病混合感染診治[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2016年22期

10 鄭志強;張永紅;鄭世學;;鴨疫里默氏桿菌病的研究進展[J];養(yǎng)禽與禽病防治;2017年03期

相關會議論文 前10條

1 陳基明;汪敏;徐子恒;磨美蘭;韋平;;2015-2019年鴨疫里默氏桿菌的流行病學調查[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)食品衛(wèi)生學分會第十五次學術交流會論文集[C];2019年

2 劉玲俐;蘇觀志;趙亞楠;王少輝;田明星;祁晶晶;李濤;于圣青;;鴨疫里默氏桿菌質粒介導利福平耐藥機制研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)食品衛(wèi)生學分會第十五次學術交流會論文集[C];2019年

3 陳國權;周碧君;張旭;趙大杰;閻朝華;;一株鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第二十五次學術交流會、中國病理生理學會動物病理學專業(yè)委員會第二十四次學術研討會、中國實驗動物學會實驗病理學專業(yè)委員會第四次學術研討會、中國獸醫(yī)病理學家第四次研討會論文集[C];2019年

4 董航;程榮華;蘇雙;姚新華;邵洪澤;;鴨疫里默氏桿菌感染的診治[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2015年

5 ;鴨疫里默氏桿菌基因組測序及比較分析[A];第六屆(2015)中國水禽發(fā)展大會論文匯編[C];2015年

6 于圣青;胡青海;韓先干;王小蘭;丁鏟;王少輝;鄒潔馳;;鴨疫里默氏桿菌研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2014年學術年會論文集[C];2014年

7 周小進;胡青海;韓先干;朱寅玉;丁鏟;于圣青;;鴨疫里默氏桿菌交叉反應性單克隆抗體的研制[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術研討會論文集[C];2010年

8 廖永洪;邵華斌;楊峻;羅玲;王紅琳;羅青平;溫國元;張蓉蓉;艾地云;;湖北1型鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十五次學術研討會論文集[C];2010年

9 柴虹;馬康康;王永明;朱萬光;李士成;;鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會2010年學術年會（第三屆中國獸藥大會學術論壇）論文集[C];2010年

10 楊芳芳;孫亞妮;李井新;王輝;趙夢嬌;蘇晶;張振軍;柳洪潔;謝之景;朱巖麗;姜世金;;鴨疫里默氏桿菌中氨基糖苷類鈍化酶基因的檢測及分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集[C];2012年

相關重要報紙文章 前4條

1 河北省邯鄲市畜牧技術推廣站 吳志勇;鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2019年

2 沙河市示范飼料廠 張占江;如何防治鴨疫里默氏桿菌病[N];河北科技報;2015年

3 山西恒豐強動物藥業(yè)有限公司技術部 高懷濤;一例鴨疫里默氏桿菌病的診治[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年

4 林東祥;鴨疫里默氏桿菌病[N];中國畜牧報;2002年

相關博士學位論文 前8條

1 Kanwar Kumar;鴨疫里默氏桿菌AS87_08785基因編碼IX型分泌系統(tǒng)的功能組分GldK[D];中國農業(yè)科學院;2019年

2 劉洪明;鴨疫里默氏桿菌分離株外膜蛋白（ompA）基因的克隆、表達及其單克隆抗體制備[D];甘肅農業(yè)大學;2017年

3 王小蘭;鴨疫里默氏桿菌煙酰胺酶基因的鑒定及功能研究[D];中國農業(yè)科學院;2018年

4 王小蘭;鴨疫里默氏桿菌毒力基因的鑒定及功能分析[D];中國農業(yè)科學院;2015年

5 李繼祥;鴨疫里默氏桿菌致病相關因子研究[D];西南大學;2009年

6 高繼業(yè);RaGAPDH的發(fā)現(xiàn)及其在R.anatipestifer致病中的作用研究[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

7 王曉佳;不同血清型的鴨疫里默氏桿菌全基因組結構特點[D];四川農業(yè)大學;2013年

8 仲崇岳;鴨疫里默氏桿菌基因分型及耐藥機理的研究[D];四川農業(yè)大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳妍;鴨疫里默氏桿菌gldL基因缺失株的構建及培養(yǎng)上清中免疫原性蛋白的鑒定[D];揚州大學;2019年

2 馮言;鴨疫里默氏桿菌亞鐵離子轉運系統(tǒng)Feo的功能研究[D];四川農業(yè)大學;2018年

3 岳慧賢;鴨疫里默氏桿菌tonB基因的調控及功能分析[D];四川農業(yè)大學;2018年

4 陳宗超;GldM蛋白在鴨疫里默氏桿菌致病過程中的作用機制[D];中國農業(yè)科學院;2019年

5 楊永勝;鴨疫里默氏桿菌gldN和tbdR3基因缺失株的構建及其生物學特性分析[D];中國農業(yè)科學院;2019年

6 吉果;鴨疫里默氏桿菌RA-GD株RecA基因的功能研究[D];中國農業(yè)科學院;2019年

7 李生斗;鴨疫里默氏桿菌ABC外排泵的RIA_1614基因功能研究[D];中國農業(yè)科學院;2019年

8 包細明;鴨主要病原菌耐藥性分析及噬菌體的分離鑒定[D];貴州大學;2019年

9 稅蕓;鴨疫里默氏桿菌CH-1株B739_1343基因缺失株的構建及免疫保護效果評價[D];四川農業(yè)大學;2017年

10 李嶺;鴨疫里默氏桿菌HmuY-like蛋白的功能研究[D];四川農業(yè)大學;2017年

本文編號：2624345