【摘要】：圍產(chǎn)期奶牛由于食欲下降,干物質(zhì)攝入減少,而能量需求增多,容易引起能量負(fù)平衡。在這種狀態(tài)下,機(jī)體會(huì)大量動(dòng)員脂肪組織,以彌補(bǔ)能量需求。脂肪動(dòng)員產(chǎn)生游離脂肪酸,其在肝臟不完全氧化會(huì)產(chǎn)生大量酮體,容易導(dǎo)致奶牛酮病。酮病奶牛表現(xiàn)為系統(tǒng)性氧化應(yīng)激,而代謝旺盛的脂肪組織是否存在氧化應(yīng)激,目前尚不清楚。熱休克蛋白(HSPs)是機(jī)體由于受到化學(xué)、物理和生物因子等刺激而導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的抵抗應(yīng)激的一類蛋白質(zhì)。近幾年發(fā)現(xiàn),熱休克蛋白B7(HSPB7)在抗氧化、保護(hù)機(jī)體損傷等方面發(fā)揮重要作用,然而,在酮病奶牛脂肪組織中HSPB7是否有抗氧化作用,目前尚不清楚。此外,眾所周知核因子E2相關(guān)因子2(NFE2L2)在機(jī)體內(nèi)主要參與抗氧化過(guò)程,HSPB7與NFE2L2信號(hào)通路是否有聯(lián)系,還待進(jìn)一步研究。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)采集臨床酮病奶牛和健康奶牛脂肪組織,檢測(cè)臨床酮病奶牛脂肪組織中是否存在氧化應(yīng)激及HSPB7和NFE2L2的表達(dá)變化。體外分離培養(yǎng)犢牛脂肪細(xì)胞,分別添加不同濃度的H_2O_2,模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài),研究犢牛脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激對(duì)HSPB7、NFE2L2及其下游靶基因血紅素氧合酶-1(HMOX1)和NADH醌氧化還原酶1(NQO1)的影響,并通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HSPB7的腺病毒和干擾HSPB7的siRNA,以期了解HSPB7對(duì)犢牛脂肪細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的作用及機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了健康奶牛和臨床酮病奶牛脂肪組織中抗氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性和氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)的含量,結(jié)果表明臨床酮病奶牛脂肪組織中的MDA含量顯著高于健康奶牛,而SOD和GSH-Px活性顯著低于健康奶牛,說(shuō)明臨床酮病奶牛脂肪組織中存在氧化應(yīng)激。同時(shí),檢測(cè)了脂肪組織中HSPB7和NFE2L2的表達(dá)量,結(jié)果表明,臨床酮病奶牛脂肪組織中HSPB7和NFE2L2的表達(dá)量均高于健康奶牛,說(shuō)明HSPB7在臨床酮病奶牛脂肪組織中發(fā)揮作用,且NFE2L2信號(hào)通路被激活。體外培養(yǎng)犢牛脂肪細(xì)胞,添加不同濃度的H_2O_2(0、25、50、100、200和400μM)作用2 h。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,添加H_2O_2濃度為25、50、100、200和400μM的實(shí)驗(yàn)組活性氧(ROS)和MDA的含量隨著H_2O_2濃度增加而顯著升高,SOD和GSH-Px的活性隨著H_2O_2濃度增加而顯著降低。此外,25、50和100μM H_2O_2促進(jìn)HSPB7和NFE2L2 mRNA和蛋白表達(dá),并促進(jìn)NFE2L2下游靶基因HMOX1和NQO1的mRNA表達(dá),而200和400μM H_2O_2抑制HSPB7和NFE2L2 mRNA和蛋白表達(dá),并抑制NFE2L2下游靶基因HMOX1和NQO1的mRNA表達(dá)。體外培養(yǎng)犢牛脂肪細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)HSPB7的腺病毒(Ad-HSPB7)作用48 h,添加200μM H_2O_2作用2 h。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)HSPB7減弱H_2O_2對(duì)NFE2L2、HMOX1和NQO1表達(dá)的抑制作用,且過(guò)表達(dá)HSPB7增加SOD和GSH-Px的活性,降低MDA和ROS的產(chǎn)生,從而改善H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。將脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(si-HSPB7)48 h,添加200μM H_2O_2作用2 h。結(jié)果表明,干擾HSPB7加劇H_2O_2對(duì)NFE2L2、HMOX1和NQO1表達(dá)的抑制作用,且干擾HSPB7加劇H_2O_2對(duì)SOD和GSH-Px活性的降低,并增加MDA和ROS的產(chǎn)生,表明干擾HSPB7會(huì)加重犢牛脂肪細(xì)胞中的氧化應(yīng)激。以上結(jié)果表明,臨床酮病奶牛脂肪組織存在氧化應(yīng)激,且HSPB7和NFE2L2的表達(dá)升高。在犢牛脂肪細(xì)胞中,HSPB7通過(guò)激活NFE2L2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。
【圖文】：

脂肪組織 TG 分解生成的 NEFA 是某些代謝性疾病炎，也是奶牛過(guò)渡期代謝性疾�。ㄖ靖�、酮癥）和感染性）的重要誘導(dǎo)因素[40,41]。高濃度 NEFA 可激活炎癥通路，因子 α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白介素因子的期奶牛對(duì)乳腺炎、子宮炎等感染性疾病很敏感。進(jìn)入肝臟外，也可在肝細(xì)胞中重新酯化生成 TG，TG 必須通過(guò)極ow-density lipoprotein, VLDL）才能輸出肝臟，但由于反芻奶牛肝臟合成 VLDL 的速度非常慢，但合成 TG 的速度與肝臟的 TG 合成速率超過(guò)了水解或 VLDL 轉(zhuǎn)運(yùn)速率時(shí)，就肝會(huì)進(jìn)一步加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而增加機(jī)體的患病風(fēng)險(xiǎn)牛脂肪組織提供能量緩解 NEB 的同時(shí)，其代謝物也可能致一系列疾病發(fā)生概率增加，，因此，對(duì)于脂肪組織的代謝渡期奶牛疾病的預(yù)防和治療是很必要的。

并與一種小的MAF蛋白質(zhì)異二聚體化，異二聚體識(shí)別ARE[143]，即存在于NFE2L2靶基因調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子序列，對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的激活至關(guān)重要。NFE2L2可影響近500個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，這些蛋白質(zhì)包括氧化還原平衡因子、解毒酶、應(yīng)激反應(yīng)蛋白和代謝酶等[144]。3.2 NFE2L2 信號(hào)通路NFE2L2信號(hào)通路是細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要機(jī)制之一[145]。在正常生理狀態(tài)下，NFE2L2通過(guò)與Keap1結(jié)合并錨定在細(xì)胞質(zhì)中，保持抑制狀態(tài)。然而，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，NFE2L2進(jìn)入細(xì)胞核與MAF異二聚體化，并與ARE結(jié)合，隨后激活下游抗氧化基因，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗氧化作用，如血紅素加氧酶-1（HMOX1）、NADH醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等（圖2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2623774