【摘要】：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis Type 2,SS2)是誘發(fā)細(xì)菌性腦膜炎的一種重要病原菌,烯醇化酶(Enolase,ENO)是SS2感染誘發(fā)腦膜炎過(guò)程中的重要毒力分子。本課題組前期發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌2型烯醇化酶(SS2-ENO)誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)凋亡過(guò)程中,細(xì)胞熱休克蛋白60(HSPD1)含量顯著升高,但其具體作用尚不明確。因此,本研究針對(duì)HSPD1介導(dǎo)SS2-ENO誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制展開(kāi)以下研究。為探討HSPD1在ENO誘導(dǎo)BMEC凋亡中的作用,本研究通過(guò)Western blot、等方法,分析HSPD1含量對(duì)BMEC凋亡的影響。研究結(jié)果表明:ENO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中,胞內(nèi)和胞外HSPD1含量升高。且胞內(nèi)過(guò)表達(dá)HSPD1和胞外添加HSPD1可促進(jìn)ENO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;胞內(nèi)敲低HSPD1和胞外抗體阻斷HSPD1,會(huì)抑制該凋亡。證明HSPD1可促進(jìn)ENO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為研究HSPD1在ENO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的定位,本研究通過(guò)熒光標(biāo)記等方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,在ENO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中,線粒體HSPD1含量逐漸減少,胞漿HSPD1含量逐漸增多,HSPD1逐漸由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)移。線粒體滲透性也隨之改變。說(shuō)明ENO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中,線粒體膜滲透性增大,致使HSPD1由線粒體向胞漿、進(jìn)而向胞外發(fā)生轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步對(duì)胞內(nèi)胞外HSPD1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行研究。通過(guò)Co-IP、免疫熒光染色等方法驗(yàn)證胞內(nèi)HSPD1的互作蛋白并分析其參與的信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)HSPD1的互作蛋白為actin,并通過(guò)Smac-XIAP-Caspase 3信號(hào)通路介導(dǎo)凋亡發(fā)生。TLR4介導(dǎo)了胞外HSPD1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。最后為驗(yàn)證HSPD1對(duì)血腦屏障(BBB)通透性的影響,以體外BBB共培養(yǎng)模型和健康小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示體外模型添加HSPD1或小鼠尾靜脈注射HSPD1后,體外BBB模型的TEER值顯著降低,小鼠體內(nèi)腦組織攝入的伊藍(lán)染料濃度升高,證實(shí)HSPD1可以增加BBB的通透性。本研究證實(shí),ENO誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,可使胞內(nèi)胞外HSPD1含量升高,并由線粒體向胞漿、胞外轉(zhuǎn)移,增加血腦屏障的通透性。該研究闡明了HSPD1對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及其對(duì)BBB通透性的影響,豐富了人們對(duì)HSPD1功能上的認(rèn)識(shí),也為SS2腦膜炎致病機(jī)制的研究提供重要的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

第一篇 文獻(xiàn)綜述第 1 章 烯醇化酶致病性的研究進(jìn)展1 ENO 的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及分布烯醇化酶（Enolase，ENO）是一種廣泛分布的胞漿金屬酶。在系統(tǒng)分類上，ENO 屬于烯醇化酶超家族，如圖 1 所示，該家族包括扁桃酸鹽消旋酶（MR）、粘康酸鹽環(huán)異構(gòu)酶（MLE）和烯醇化酶（ENO）本身共三類[1]。在生物結(jié)構(gòu)上，該家族的酶結(jié)構(gòu)比較保守，且具有一定的相似性，均具有一個(gè)小的 N 端區(qū)域和大的 C 端區(qū)域。ENO 會(huì)以低聚體、二聚體或八聚體的形式存在。在真核細(xì)胞和大多數(shù)的原核細(xì)胞內(nèi)，ENO 多以二聚體的形式存在[2]，而在原核生物中，這幾種形式均有存在[3]。

1 HSPD1 的結(jié)構(gòu)、分布與功能分子伴侶蛋白參與維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的生理功能，當(dāng)伴侶分子的組成結(jié)構(gòu)，表達(dá)含量，細(xì)胞定位等情況發(fā)生變異后，會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生，例如分子伴侶病等。大量研究已經(jīng)證實(shí)伴侶分子是多種疾病的致病因子。伴侶家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是具有兩個(gè)疊層七亞基環(huán)的四聚體結(jié)構(gòu)[56]，具有蛋白折疊的功能[57]。真核生物伴侶蛋白 I，也稱 HSP60、HSPD1、GroEL，主要分布于線粒體中，在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜、細(xì)胞外液、分泌物及一些細(xì)胞衍生的囊泡中也有存在[58-61]，該蛋白是由 HSPD1 基因編碼所形成的 60 kD 蛋白，行使伴侶功能[62]。線粒體中的 HSPD1 具有協(xié)助蛋白折疊和增加蛋白熱應(yīng)激的功能[63]。典型的熱休克蛋白復(fù)合物是由兩個(gè)獨(dú)立的七個(gè)相同亞基環(huán)繞結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，因此該復(fù)合物是一個(gè)含有中央腔的四聚體[64]，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在其發(fā)揮蛋白折疊功能的過(guò)程中扮演十分重要的角色。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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