【摘要】：綿羊瘤胃上皮作為與環(huán)境接觸的免疫界面,能夠分泌具有針對各種病原體的抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)。防御素作為機體內(nèi)正常產(chǎn)生的AMPs,具有廣譜的抗微生物活性,而綿羊β-防御素-1(Sheep β-defensin-1,SBD-1)作為防御素家族的一員,在整個胃腸道內(nèi)廣泛表達,因此SBD-1可能在綿羊胃腸道先天性免疫中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期的研究表明釀酒酵母菌及其全細胞壁均能誘導綿羊瘤胃上皮細胞(Ovine ruminal epithelial cells,ORECs)內(nèi)SBD-1的表達,而甘露聚糖作為釀酒酵母細胞壁的主要成分,具有刺激先天性和適應性免疫反應功能。因此,本試驗首先對ORECs的培養(yǎng)、凍存和復蘇方法進行研究,然后研究了釀酒酵母甘露聚糖對ORECs SBD-1的表達影響,最后對甘露聚糖誘導SBD-1表達所激活的信號通路進行探索。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)采用胰蛋白酶連續(xù)消化法對瘤胃組織分別進行7次不同時間(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并對每次消化后的瘤胃組織和細胞進行觀察,以確定消化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4次消化后即可開始收集細胞,并進行原代培養(yǎng)。同時運用差時消化法和差速貼壁法對培養(yǎng)的細胞進行純化,并利用免疫組化、免疫熒光、細胞生長曲線和RT-PCR方法證實所培養(yǎng)的細胞為ORECs。然后通過檢測復蘇后的細胞活力和24 h貼壁率發(fā)現(xiàn)凍存液的配制比例為VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1時,冷凍保護效果較好。最后對復蘇后的ORECs生物學活性進行檢測,結(jié)果表明復蘇后的細胞同樣具有原代ORECs的生物學特性,可用于后續(xù)試驗研究。(2)用不同濃度(0、10、50、100、200和400 μg/mL)的甘露聚糖刺激ORECs 8 h后,篩選出甘露聚糖誘導SBD-1表達的最佳濃度;然后用最適濃度的甘露聚糖刺激ORECs不同時間(0、2、4、8、12和24 h)后,篩選出甘露聚糖誘導SBD-1表達的最佳時間。qPCR和ELISA結(jié)果均顯示甘露聚糖能夠誘導ORECs SBD-1的表達,且當濃度為50 μg/mL的甘露聚糖刺激ORECs4h時SBD-1的表達量達到最大。(3)采用Western blot、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光、qPCR和ELISA方法對甘露聚糖誘導SBD-1表達所激活的信號通路進行研究。結(jié)果表明:膜受體樹突狀細胞相關 C 型凝集素 2(Dendritic-cell-associated C-type lectin 2,Dectin-2)和信號銜接蛋白脾臟酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)在ORECs內(nèi)均表達,并且用Dectin-2和TLR-2的siRNA或特異性封閉抗體處理ORECs后均可以減弱甘露聚糖誘導SBD-1的表達,且阻斷Dectin-2對SBD-1表達的抑制作用更明顯。然后用Syk siRNA或Syk特異性抑制劑R406處理細胞后同樣發(fā)現(xiàn)阻斷Syk能夠降低甘露聚糖誘導SBD-1的表達。最后分別用p38、JNK、ERK1/2和NF-κB信號通路的特異性抑制劑處理ORECs后均顯著降低甘露聚糖誘導SBD-1的表達,且p38通路抑制劑效果最明顯。本研究通過消化時間的確定,成功培養(yǎng)出了 ORECs。凍存液的配制比例為VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1時,對ORECs的冷凍保護效果較好,且復蘇后的細胞同樣具有原代ORECs的生物學特性。此外,甘露聚糖能夠誘導ORECs SBD-1的表達,且膜受體Dectin-2和TLR-2,信號銜接蛋白Syk以及下游的信號通路p38、JNK、ERK1/2和NF-κB均參與甘露聚糖誘導SBD-1的表達過程,但可能以Dectin-2-Syk-p38信號通路為主要的信號通路。
【圖文】：

防御素基因編碼結(jié)構示意圖(90模型中黃色部分為二硫鍵)hzlFig.l-ISchematicdiagramofthecodingstructureofdefensingene(disulfidebondscolored州lowin3Dmodel)

圖１－２防御素的生物學活性逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｄｃｆｃｎｓｉｎｓ逡逑
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.2

【參考文獻】

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1 詹康;貢笑笑;左曉昕;陳銀銀;占今舜;趙國琦;;奶牛乳腺上皮細胞系的培養(yǎng)與鑒定[J];動物營養(yǎng)學報;2015年08期

2 謝芳;潘寒Y，

本文編號：2618384