【摘要】：沙門氏菌不僅能引起家禽發(fā)病死亡造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且被沙門氏菌污染的家禽產(chǎn)品會(huì)嚴(yán)重危害人類健康。研究表明,外源添加人溶菌酶能顯著抑制雞沙門氏菌病的發(fā)生。本文利用構(gòu)建好的重組人溶菌酶轉(zhuǎn)基因雞模型,與非轉(zhuǎn)基因雞比較,測(cè)定雞腸炎沙門氏菌攻毒后雞盲腸和脾臟組織的載菌量、血清IgG水平、腸粘膜IgA分泌、盲腸中細(xì)胞因子和雞體重的變化,以及對(duì)心臟、肝臟、脾臟和盲腸所造成的炎性損傷,從組織和分子水平上系統(tǒng)研究重組人溶菌酶對(duì)雞腸道粘膜免疫的影響,為雞抗病育種提供重要的理論依據(jù)。首先,我們對(duì)構(gòu)建好的高效表達(dá)重組人溶菌酶轉(zhuǎn)基因農(nóng)大三號(hào)小型蛋雞進(jìn)行擴(kuò)繁,通過(guò)PCR雙引物鑒定的方法優(yōu)化了外源基因檢測(cè)手段,并采用Southern blot方法進(jìn)一步確定了外源基因的整合,成功鑒定出194只攜帶人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因雞。接著,利用ELISA方法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因雞血清中人溶菌酶的平均濃度為29.90±6.50μg/mL;另外,通過(guò)抑菌圈法和稀釋平板擴(kuò)增法檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因雞蛋清中人溶菌酶的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因雞蛋清溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的抗菌活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因雞(P0.05);對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因雞糞便進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),檢測(cè)其中五種細(xì)菌的數(shù)量(乳酸桿菌、沙門氏菌、雙歧桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因雞腸道雙歧桿菌的數(shù)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因雞(P0.05);此外,轉(zhuǎn)基因雞的六周脛長(zhǎng)、六周體重和十八周體重較非轉(zhuǎn)基因雞均顯著增加。隨后,為了驗(yàn)證重組人溶菌酶轉(zhuǎn)基因雞對(duì)沙門氏菌病的抑制作用,我們選取來(lái)自同一家系的10只G2代轉(zhuǎn)基因公雞與G2代非轉(zhuǎn)基因母雞交配,收集300枚受精蛋,孵化出232只G3代雛雞。將232只G3代雛雞隨機(jī)分成兩組:攻毒組和對(duì)照組,攻毒組于1日齡口服雞腸炎沙門氏菌懸液1x108CFU/mL 0.2 mL/只,對(duì)照組口服等量無(wú)菌PBS,分別飼養(yǎng)于隔離倉(cāng)中。在攻毒后1 d、3d、7 d和14 d時(shí)分別對(duì)感染雛雞和未感染雛雞進(jìn)行屠宰采樣,檢測(cè)不同組的感染情況,同時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)性能、組織病理學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明:①不論是否感染腸炎沙門氏菌,轉(zhuǎn)基因雞體重均顯著高于非轉(zhuǎn)基因雞;②在7 dpi和14 dpi時(shí),相較于非轉(zhuǎn)基因雞,轉(zhuǎn)基因雞表現(xiàn)出更輕微的組織病變;③在7 dpi和14 dpi時(shí),轉(zhuǎn)基因雞盲腸中腸炎沙門氏菌的載菌量顯著低于非轉(zhuǎn)基因雞(P0.05),盡管脾臟中腸炎沙門氏菌的載菌量較高,但與對(duì)照組相比未達(dá)到顯著水平(P0.05);④在14 dpi時(shí),感染腸炎沙門氏菌的轉(zhuǎn)基因雞血清中IgG水平顯著高于未感染的轉(zhuǎn)基因雞(P0.05);另外,在7 dpi和14 dpi時(shí),感染腸炎沙門氏菌轉(zhuǎn)基因雞腸黏膜分泌的IgA含量達(dá)到最大值,并顯著高于其它三組(P0.05);感染腸炎沙門氏菌后,轉(zhuǎn)基因雞IFNI的表達(dá)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因雞(P0.05)。綜上所述,本論文通過(guò)重組人溶菌酶轉(zhuǎn)基因雞模型研究發(fā)現(xiàn),重組人溶菌酶對(duì)雞腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用,可以促進(jìn)腸道雙歧桿菌的增長(zhǎng)及出生后增重。另外重組人溶菌酶可通過(guò)改善雞腸道炎性損傷并提前誘發(fā)體液免疫,增強(qiáng)雞自身對(duì)沙門氏菌病的抑制作用。
【圖文】：

制大腸桿菌、沙門氏菌等引起的仔豬腹瀉，降低仔豬腹瀉率，改善仔豬的生存狀況，提高養(yǎng)豬效逡逑益。逡逑三、抗山羊、奶牛乳房炎：隨著生物反應(yīng)器技術(shù)的不斷成熟，人們己經(jīng)能成功制備乳腺中表逡逑達(dá)重組人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊和轉(zhuǎn)基因奶牛，高效表達(dá)的重組人溶菌酶羊奶和牛奶能顯著殺傷大逡逑腸桿菌和金黃色葡萄桿菌，有效抑制山羊和奶牛乳房炎的發(fā)生［９２］。逡逑四、臨床應(yīng)用藥物：利用溶菌酶己經(jīng)研制出了大量的臨床藥物，如溶菌酶含片、溶菌酶腸溶逡逑片等，目前在市面上流傳甚廣，可明顯改善皮膚、口腔、上呼吸道等疾病癥狀，對(duì)人類健康帶來(lái)逡逑積極影響［９３］。逡逑五、食品工業(yè)上的應(yīng)用：溶菌酶具有廣譜抗菌特性，目前己被廣泛用于青酒、料酒、飲料、逡逑肉質(zhì)品、蛋糕及水產(chǎn)品食物防腐劑中［９４￣］。溶菌酶的耐熱性刺激了奶制品超高溫瞬間殺菌技術(shù)的逡逑成熟發(fā)展［１００］。重組人溶菌酶還可以用于乳酪加工，顯著縮短牛奶凝乳時(shí)間［１°１］。逡逑１．３．３人溶菌酶概述逡逑人溶菌酶（ｈＬＺ）是一類Ｃ型溶菌酶，分子量為１４．６邋ＫＤ，由１３０個(gè)氨基酸組成，含有４個(gè)二逡逑硫鍵［１0２＿１0５］。不同種類溶菌酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸組成和排列順序差異巨大，但高級(jí)結(jié)構(gòu)非常類似，逡逑體現(xiàn)溶菌酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)化保守性［１0６］。近年來(lái)，隨著人們對(duì)人溶菌酶功能的不斷挖掘，發(fā)現(xiàn)人溶菌逡逑酶表現(xiàn)一定的抗病毒、增強(qiáng)免疫力以及抗腫瘤功效，加深了人溶菌酶在臨床研宄中的應(yīng)用價(jià)值。逡逑

圖２－１邋Ｓｏｕｔｈｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ轉(zhuǎn)膜示意圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ａｂｏｕｔ邋Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｉｎ邋Ｓｏｕｔｈｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑固定膜：逡逑１）小心移去上方的方巾紙、濾紙，沿膠孔將膜和膠的上方一起剪掉，并把膜和膠的右上角逡逑剪掉以作標(biāo)記，膠放入ＥＢ溶液染色，，觀察轉(zhuǎn)膜效果；逡逑２）將膜放入裝有２ＸＳＳＣ的保鮮盒中，漂洗１０邋ｍｉｎ，將膜取出平鋪于２ＸＳＳＣ預(yù)先浸潤(rùn)的逡逑濾紙表面（膜的正面朝上），放入紫外交聯(lián)儀中，紫外交聯(lián)１５０邋ｓ。逡逑（３）雜交逡逑１）預(yù)雜交：將雜交管中裝滿去離子水，趕走氣泡，將膜放入雜交管中（膜的正面向內(nèi)），逡逑使其貼壁無(wú)氣泡，慢慢倒出去離子水，加入１５邋ｍＬ邋ＤＩＧ邋Ｈｙｂ邋ｅａｓｙ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋４５邋°Ｃ雜交管中雜交ｌｈ逡逑左右；逡逑２）變性探針：取２0ｎＬ（６０ｎｇ４ｉＬ）ＤＩＧ標(biāo)記好的探針（每毫升雜交液中加入２＾ＬＰＣＲ標(biāo)記逡逑好的探針），加１００邋ＨＬｄｄＨ２０，邋１００邋°Ｃ煮沸１０邋ｍｉｎ，冰上驟冷３邋ｍｉｎ；逡逑３）雜交：ＢＤ管中４５邋°Ｃ預(yù)熱１０邋ｍＬ雜交液，將變性完全的探針全部加入并混勾，倒出雜逡逑，，４５邋°Ｃ。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2617440