【摘要】：雄性生殖干細胞(male germ stem cell,mGSCs),同樣被稱作精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是位于睪丸曲細精管基底膜上,既能通過自我更新維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定,又能在體內(nèi)定向分化并最終形成精子的一類成體干細胞。雄性生殖干細胞可以作為研究精子發(fā)生、減數(shù)分裂調(diào)控和細胞重編程的一個理想體外模型。Double sex and mab-3 related transcription factor 1(DMRT1)基因編碼的蛋白質(zhì)包含一個double sex/mab-3結構域,無論是在脊椎動物或者無脊椎動物中,這個最保守的結構域都會參與個體的性別決定過程。除此之外,DMRT1參與雄性生殖干細胞的損傷修復、抑制睪丸腫瘤、維持雄性生殖干細胞有絲分裂與減數(shù)分裂的平衡并且調(diào)控雄性生殖干細胞的多能性。因此,探究DMRT1在雄性生殖干細胞中的功能機制,可以為提高動物遺傳育種、動物疾病模型和物種保護提供理論指導。在本研究中我們首次研究了DMRT1對山羊雄性生殖干細胞分化和自我更新過程中的影響,以及DMRT1在睪丸生殖免疫中發(fā)揮的功能。實驗結果如下:1.DMRT1基因在哺乳動物中廣泛存在且不同物種中序列高度保守,多序列比對的結果發(fā)現(xiàn)6種哺乳動物的DMRT1基因序列一致性達到了86.42%。對于其核心結構域DM結構域分析表明,不同物種的氨基酸序列基本一致,說明DM結構域在不同物種中同樣具有高度保守性。為了探究DMRT1在山羊不同組織的表達情況,免疫熒光染色結果表明DMRT1在山羊睪丸中特異表達。染色及定量PCR進一步發(fā)現(xiàn)DMRT1在1月齡山羊睪丸的表達量很低,3月齡睪丸起始減數(shù)分裂后DMRT1表達明顯上調(diào),至個體成熟其表達水平趨于穩(wěn)定。其次,利用免疫熒光共染色揭示了DMRT1主要定位在未分化和分化中的雄性生殖干細胞中,但是在啟動減數(shù)分裂的精母細胞中卻沒有表達。根據(jù)以上結果,我們認為DMRT1主要在雄性生殖干細胞中發(fā)揮功能,對于mGSCs的分化和增殖發(fā)揮重要作用。2.FUW-TetO-Dmrt1慢病毒載體配合rtTA輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雄性生殖干細胞及永生化的mGSCs-I-SB細胞系,篩選出最適誘導DMRT1表達的Dox濃度。EDU、雙熒光素酶檢測、免疫熒光染色、Western blotting、及定量PCR進一步揭示DMRT1對于山羊雄性生殖干細胞發(fā)育過程的功能。在1μg/mL Dox誘導條件下,雄性生殖干細胞增殖能力及分化水平顯著增高,減數(shù)分裂相關標記相應下調(diào)。維甲酸引起雄性生殖干細胞的減數(shù)分裂,但過表達DMRT1抑制減數(shù)分裂的發(fā)生同時mGSCs的增殖標記PCNA及分化標記c-KIT表達上調(diào)。因此DMRT1一方面促進雄性生殖干細胞的增殖和分化,另一方面抑制由RA引起的減數(shù)分裂異常起始,從而維持精原細胞有絲分裂和減數(shù)分裂的平衡。3.DMRT1在睪丸生殖免疫中發(fā)揮重要功能,DMRT1通過抑制TLRs信號通路從而降低雄性生殖干細胞中炎癥反應的發(fā)生。shRNA干擾睪丸雄性生殖干細胞中DMRT1的表達,轉(zhuǎn)錄組測序及免疫組化試驗結果顯示mGSCs中TLR4及NF-κB被激活。ELISA及Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)雄性生殖干細胞內(nèi)促炎因子TNFα及IL-6的表達上調(diào)。免疫共沉淀及雙熒光素酶檢測試驗進一步揭示DMRT1招募PLZF蛋白,二者共同抑制TLR4和NF-κB的轉(zhuǎn)錄并促進雄性生殖干細胞數(shù)量的回補。與此同時,TUNEL染色及流式細胞術發(fā)現(xiàn)DMRT1抑制由炎癥反應引起的雄性生殖干細胞的凋亡。綜合以上結果表明DMRT1在促進雄性生殖干細胞自我更新及維持睪丸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的重要功能,提供了治療睪丸生殖缺陷疾病的新思路。4.白消安處理的小鼠睪丸表現(xiàn)出嚴重的生殖細胞損傷,過表達DMRT1顯著恢復了雄性生殖干細胞的數(shù)量并且維持精子發(fā)生的正常進行。免疫熒光染色及ELISA檢測的結果表明DMRT1促進雄性生殖干細胞增殖標記PCNA、VASA及自我更新相關標記PLZF及CSF1R的表達。同時mGSCs自我更新相關的細胞因子GDNF、CSF1表達上調(diào),從而證明DMRT1對睪丸內(nèi)環(huán)境的重建至關重要�；陔p分子熒光互補技術(BiFC)和免疫共沉淀檢測,最終確認DMRT1蛋白與PLZF蛋白互作主要是由DMRT1與PLZF的BTB結構域互作來實現(xiàn)的。所以DMRT1與PLZF發(fā)揮協(xié)同作用參與雄性生殖干細胞自我更新下游通路的調(diào)節(jié)。除此之外,DMRT1和PLZF作為抑炎因子有效地抑制曲細精管內(nèi)炎癥的發(fā)生,為雄性生殖細胞損傷的修復建立了良好的微環(huán)境。綜上所述,我們首次探究了DMRT1在雄性生殖干細胞中的表達模式,探索了DMRT1對山羊雄性生殖干細胞分化和自我更新過程的影響,并揭示DMRT1在生殖免疫中發(fā)揮的功能�；蛐揎椵d體轉(zhuǎn)染山羊雄性生殖干細胞,體內(nèi)體外綜合分析、驗證篩選DMRT1可能作用的特異靶基因及其互作機制,為研究山羊雄性生殖干細胞的自我更新、精子發(fā)生的機理提供新的科學依據(jù);為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家畜的遺傳、繁育和不育癥的防治提供新方案。
【圖文】：

圖 1-1 PGCs 向精子細胞分化示意圖 (Griswold et al. 2013)。 1-1 The pattern of PGCs differentiate into sperm cells (Griswold et al. 20殖干細胞微環(huán)境研究進展生殖干細胞與微環(huán)境干細胞與其生存的周圍環(huán)境被稱為雄性生殖干細胞微環(huán)境1-2A)，這個微環(huán)境主要包括曲細精管基底膜、支持細胞、管管內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)以及細胞分子等 (Bhang et al. 20胞主要定位在曲細精管基底膜上，受多種基因的調(diào)控和內(nèi)因此這個微環(huán)境構成了調(diào)控雄性生殖干細胞自我更新與分2018; Dadoune 2007)。

圖 1-1 PGCs 向精子細胞分化示意圖 (Griswold et al. 2013)。Fig 1-1 The pattern of PGCs differentiate into sperm cells (Griswold et al. 2013).1.2 雄性生殖干細胞微環(huán)境研究進展1.2.1 雄性生殖干細胞與微環(huán)境雄性生殖干細胞與其生存的周圍環(huán)境被稱為雄性生殖干細胞微環(huán)境或雄性生殖胞龕 (圖 1-2A)，這個微環(huán)境主要包括曲細精管基底膜、支持細胞、管周肌樣細胞質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)以及細胞分子等 (Bhang et al. 2018) (圖 1-2B性生殖干細胞主要定位在曲細精管基底膜上，，受多種基因的調(diào)控和內(nèi)分泌及旁分號的調(diào)節(jié)。因此這個微環(huán)境構成了調(diào)控雄性生殖干細胞自我更新與分化的強大系Bhang et al. 2018; Dadoune 2007)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S827

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本文編號：2616813