【摘要】：傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)可導(dǎo)致禽急性高度接觸性疾病,給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。IBV為囊膜病毒,屬于尼多病毒目(Nidovirale)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)。其最重要結(jié)構(gòu)蛋白之一是纖突蛋白(Spike protein,S protein),該蛋白具有高變的S1亞基和保守的S2亞基。早期研究者將S1亞基氨基端高度變異區(qū)域定義為高變區(qū)(hypervariable regions,HVRs)。經(jīng)鑒定5個中和抗原位點與HVRs共定位,且HVRs與受體結(jié)合區(qū)域(receptor-binding domain)部分重合,因而HVRs可能在IBV細(xì)胞組織嗜性、血清型和抗原性等方面發(fā)揮作用,而有必要揭示其生物學(xué)功能。本研究選擇Beaudette和ck/CH/LDL/091022毒株為研究對象。Beaudette毒株是適應(yīng)Vero細(xì)胞生長的無致病性實驗室改造毒株,ck/CH/LDL/091022是不適應(yīng)Vero細(xì)胞生長的中國QX樣腎型強毒株,且兩者不屬于同一血清型。本試驗利用反向遺傳操作系統(tǒng)拯救Beaudette重組毒株。分析比對Beaudette和ck/CH/LDL/091022的HVRs氨基酸序列,分別/同時將ck/CH/LDL/091022的HVR I(50~86 aa)、HVR II(104~140 aa)以及HVR III(274~293 aa)分別/同時替換Beaudette毒株HVR I(50~86 aa)、HVR II(104~138 aa)以及HVR III(272~291 aa)。構(gòu)建相應(yīng)載體,經(jīng)BsmB I或Bsa I酶切,片段連接成基因組全長cDNA分子,體外轉(zhuǎn)錄,電轉(zhuǎn)Vero細(xì)胞,拯救重組病毒,7株重組病毒分別命名為rHVR I、rHVR II、rHVR III、rHVR I/II、rHVR I/III、rHVR II/III、rHVR I/II/III。7株重組病毒經(jīng)鑒定,純化,滴定并檢測其致病性、組織嗜性以及血清型等生物學(xué)特性。首先,間接免疫熒光和RT-PCR試驗結(jié)果顯示7株重組毒株均可在Vero細(xì)胞生長繁殖,但是吸附宿主細(xì)胞能力有所下降,表明僅替換HVRs不能改變重組病毒細(xì)胞嗜性。其次,中和試驗結(jié)果顯示7株重組病毒與Beaudette毒株仍屬于同一血清型,盡管重組病毒與Beaudette毒株之間抗原相關(guān)系數(shù)隨著互換HVRs數(shù)目增加而下降,表明僅替換HVRs不足以改變重組病毒血清型。再次,體內(nèi)感染試驗結(jié)果顯示7株重組病毒分別感染SPF雞只,雞只不表現(xiàn)臨床癥狀,無死亡,氣管病變評分顯著低于ck/CH/LDL/091022組,僅在個別雞只氣管檢測到IBV RNA,表明僅替換HVRs未能改變重組病毒組織嗜性和致病性。最后,免疫攻毒試驗結(jié)果顯示7株重組病毒免疫雞只在ck/CH/LDL/091022毒株攻毒后,可迅速產(chǎn)生IBV特異性抗體,重組病毒免疫雞只氣管和腎臟病毒載量與PBS免疫組相比顯著降低,表明7株重組病毒可提供一定的免疫保護。本研究揭示了HVRs生物學(xué)功能,并探索新型候選疫苗,為IBV防控提供新思路。
【圖文】：

學(xué)位論文 。該項研究表明，人工單點或同時突變先導(dǎo)序列和一個或多個 T成 RNA(Pasternak et al., 2001)。TGEV 和 MHV 反向遺傳系統(tǒng)的建果(Alonso et al., 2002)。因此，這是廣泛適用于冠狀病毒和部毒，均以負(fù)鏈 RNA 合成起始復(fù)制和翻譯過程。然而，不連續(xù)翻譯證實。

因組的三分之二，包含兩個 ORF，基因的表達(dá)依賴于核糖體程序移動。冠狀病毒核由于 IBV 序列的完善，發(fā)現(xiàn) ORF1a（11.9 kb）與 ORF1b（8.1 kb）之間有一小段（4然而沒有 ORF1b 的亞基因組。這一發(fā)現(xiàn)在所有的冠狀病毒中均一致(Jacks et al., 1碼是應(yīng)用 IBV1a 與 1b 重疊區(qū)域插入報告基因構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或者細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)ey et al., 1989)。在上述系統(tǒng)中，移碼突變的發(fā)生率大約為 25~30%，遠(yuǎn)高于逆轉(zhuǎn)錄 5%。然而，IBV 或其他冠狀病毒感染細(xì)胞內(nèi)發(fā)生移碼突變概率無法量化，也無法程中移碼突變概率是否穩(wěn)定。 核糖體移碼突變依賴于兩個基因組 RNA 元件(圖 1.4)，即“移動序列（”slippery sequeAAC）和下游發(fā)卡結(jié)構(gòu)的假結(jié)（pseudoknot）(Brierley et al., 1989)。此外，這兩個元也很重要。目前推論，假結(jié)結(jié)構(gòu)阻礙了核糖體的延伸。這種阻礙有可能需要核糖體 的 P 位滑落，并向延伸相反方向移動一個堿基滑入 A 位，進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)錄延伸。研，IBV 移碼突變模型也證實核糖體在假結(jié)結(jié)構(gòu)處停止(Somogyi et al., 1993)。并且 I驗和SARS-CoV直接光譜大數(shù)據(jù)分析移碼突變多肽產(chǎn)物(Baranov et al., 2005)均證實和滑入位點。冠狀病毒為何應(yīng)用核糖體移碼突變作為基因表達(dá)策略的原因尚未清楚為反轉(zhuǎn)錄病毒利用移碼突變機制產(chǎn)生固定比例的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，，彼此相近，有利于組裝物。因此推斷，移碼突變可預(yù)先表達(dá) ORF1 產(chǎn)物，直到 ORF1a 產(chǎn)物及其細(xì)胞環(huán)境準(zhǔn)備
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S855.3

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本文編號：2610335