【摘要】：雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,MG)是引起雞慢性呼吸道疾病的病原體,感染MG的雞群主要表現(xiàn)為咳嗽、鼻炎、噴嚏、氣管Up音等呼吸道癥狀;雞群感染MG后對(duì)其它病原菌易感性增加,引起繼發(fā)感染,產(chǎn)生更為嚴(yán)重的呼吸道綜合征,從而給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前MG的致病機(jī)制的研究還不夠深入,防控技術(shù)水平比較薄弱,MG在養(yǎng)禽場(chǎng)中的平均感染率高達(dá)70%~80%。因此,開展MG致病機(jī)制的研究并探索其有效免疫原蛋白具有重要意義。支原體沒(méi)有細(xì)胞壁,細(xì)胞膜是它與外界接觸的主要結(jié)構(gòu),膜表面存在大量脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(Lipid-associated membrane proteins,LAMPs)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究鑒定GroEL蛋白為雞毒支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白LAMPs的組分,并且其可引起DF-1細(xì)胞凋亡。但DF-1細(xì)胞為傳代細(xì)胞系,并不能真實(shí)體現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷。因此本研究分離雞外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC),以PBMC作為細(xì)胞模型,探究GroEL蛋白誘導(dǎo)PBMC凋亡情況。首先構(gòu)建GroEL的重組表達(dá)質(zhì)粒,然后表達(dá)并純化出rGroEL蛋白,通過(guò)流式細(xì)胞儀和Western blot技術(shù)檢測(cè)rGroEL蛋白誘導(dǎo)PBMC凋亡情況。結(jié)果顯示:PBMC的凋亡率隨著rGroEL蛋白劑量的增加而升高,凋亡相關(guān)因子caspase3/8/9均升高,表明rGroEL蛋白可以誘導(dǎo)PBMC凋亡。為進(jìn)一步研究rGroEL蛋白誘導(dǎo)PBMC凋亡的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)室前期初步篩選出雞膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)可以與GroEL蛋白相互作用,本研究為了證實(shí)rGroEL蛋白引起PBMC的凋亡是否與Annexin A2有關(guān),將rGroEL蛋白加入PBMC培養(yǎng)基中孵育,分別加入抗GroEL蛋白和抗Annexin A2蛋白的單抗后,然后用熒光二抗進(jìn)行標(biāo)記后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果表明rGroEL蛋白可以與PBMC中內(nèi)源性Annexin A2共定位于細(xì)胞膜表面。Western blot檢測(cè)表明:用rGroEL蛋白刺激PBMC后Annexin A2蛋白表達(dá)量增加;用siRNA干擾表達(dá)Annexin A2蛋白的mRNA后再用rGroEL蛋白刺激,流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明:干擾Annexin A2表達(dá)可以降低rGroEL蛋白誘導(dǎo)PBMC的凋亡率。以上結(jié)果表明,雞毒支原體GroEL蛋白可以通過(guò)Annexin A2誘導(dǎo)PBMC凋亡。鑒于GroEL蛋白的重要作用以及其為MG重要的免疫原,為研究GroEL蛋白是否可以作為診斷抗原,本研究以rGroEL蛋白作為包被抗原初步建立了間接ELISA檢測(cè)方法,經(jīng)驗(yàn)證其敏感性較好,并且與滑液囊支原體(Mycoplasma Synoviae,MS)陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)性。然而當(dāng)用本研究中建立的間接ELISA檢測(cè)方法與商品化的MG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)同一批樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),兩者的符合率僅為63.34%。因此本研究中的rGroEL蛋白作為MG診斷抗原有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
【圖文】：

蛋白刺激 PBMC 后置刺激組和對(duì)照組，設(shè)三個(gè)重復(fù)。在 12 h 液，置于冰上裂解30 BCA 蛋白定量，剩余膠各加樣口中加入等量 的脫脂乳中封閉 2 h， 和 β-actin 的一抗，3抗，37℃孵育 45 min，設(shè)計(jì)的 groEL 上下游1605 bp 相吻合。M 1 20 bp

M 1組質(zhì)粒 pET-30a- groEL nant plasmid pET-30a- grker; 1: pET-30a- groEL 1: pET-30a- groEL diges21 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)得到了表達(dá)，，且大M 1 bp bp bp bp5 kDa kDa
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：2609205