【摘要】：異種器官移植是解決供體器官短缺的有效途徑,豬(Sus scrofa)由于器官大小、生理解剖結(jié)構與人相近、繁殖率高、飼養(yǎng)成本低等優(yōu)勢,被認為是理想的異種器官移植供體。豬器官移植到人體內(nèi)將會引起超急性免疫排斥反應(hyperacute rejection,HAR),敲除豬的α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)可以避免HAR。然而豬的細胞表面仍存在多種非半乳糖抗原,它們在豬內(nèi)皮細胞及多種器官中均有所表達,能夠在異種器官移植中引起諸如抗體沉積、補體激活等抗體介導的急性排斥反應,其中包括N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和豬的Sd~a血型抗原。N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)是由單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成的一種唾液酸。豬的Sd~a血型抗原是由豬的一種糖基轉(zhuǎn)移酶即β1,4N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)催化合成的,人類和大多數(shù)非靈長類動物都會產(chǎn)生與Sd~a血型抗原結(jié)合的抗體。本研究在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除(GGTA1knockout,GTKO)豬的基礎上利用CRISPR/Cas9和體細胞核移植技術制備CMAH基因敲除(CMAH~(-/-))巴馬小型豬和β4GalNT2基因敲除(β4GalNT2~(-/-))巴馬小型豬,并評估了CMAH~(-/-)巴馬小型豬的健康及繁育狀況。1.以GTKO豬為基礎,針對豬CMAH基因設計sgRNA并構建sgRNA/Cas9表達載體并進行活性驗證,篩選敲除效率較高的CMAH-g1,采用電轉(zhuǎn)染的方式將載體轉(zhuǎn)入巴馬豬耳成纖維細胞BMEF(Bama minipigs Ear Fibroblast),鑒定為陽性的細胞作為核供體,利用體細胞核移植技術(Somatic Cell Nuclear Transfer Technique,SCNT)制備CMAH~(-/-)豬。提取仔豬基因組進行PCR,鑒定仔豬突變類型;用Anti-Neu5Gc抗體進行免疫熒光檢測確定仔豬器官Neu5Gc表達情況。采集CMAH~(-/-)巴馬豬血液檢測其生理指標;CMAH~(-/-)巴馬公豬性成熟后配種,以母豬的產(chǎn)仔數(shù)評價CMAH~(-/-)公豬的繁育能力。結(jié)果成功獲得了-2bp/-2bp和-1bp/-1bp共2種純合敲除類型的CMAH~(-/-)巴馬豬。免疫熒光檢測結(jié)果顯示在CMAH~(-/-)豬的胰腺、主動脈表面未檢到Neu5Gc表達。與野生豬(WT)相比,CMAH~(-/-)豬血常規(guī)和血生化指標正常,CMAH~(-/-)公豬的生產(chǎn)力正常。2.以GTKO豬為基礎,針對豬β4GalNT2基因第三外顯子設計sgRNA導向序列引物,構建sgRNA/Cas9表達載體并進行活性驗證,敲除效率高的載體電轉(zhuǎn)染BMEF。采用PCR、TA克隆及測序的方法鑒定單細胞克隆的突變類型,選擇陽性克隆點作為核供體,利用體細胞核移植技術制備β4GalNT2~(-/-)豬。分離仔豬外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)與異硫氰酸熒光素標記的雙花扁豆凝集素(Fluorescein isothiocyanate conjugated Dolichos biflorus agglutinin,FITC-DBA)共孵育,檢測仔豬β4GalNT2的表達。本次使用敲除效率最高的bGal-g5制備敲除豬。經(jīng)過鑒定,成功獲得了基因型為+1bp/-3bp/-17bp的β4GalNT2基因敲除豬。細胞及仔豬鑒定結(jié)果均顯示其有三種敲除類型,說明豬β4GalNT2基因是多拷貝基因。仔豬PBMC與FITC-DBA共孵育后沒有綠色熒光,說明仔豬β4GalNT2基因已失活。3.采集WT巴馬豬、GGTA1基因敲除(GTKO)巴馬豬、CMAH~(-/-)巴馬豬、β4GalNT2~(-/-)巴馬豬的血液并分離其PBMC,與滅活的混合AB型人血清及猴血清共孵育,通過流式檢測豬PBMC與人、猴血清中抗體的結(jié)合情況。結(jié)果顯示,敲除GGTA1基因能夠有效地降低與豬PBMC結(jié)合的抗體量,在敲除GGTA1基因的基礎上敲除豬的CMAH基因或β4GalNT2基因,都能夠在原基礎上繼續(xù)降低抗體的結(jié)合量。本研究利用CRISPR/Cas9技術和體細胞核移植技術成功制備了GGTA1/CMAH基因敲除豬和GGTA1/β4GalNT2基因敲除豬,GGTA1/CMAH基因敲除豬的健康狀況和繁育能力正常。抗原抗體反應結(jié)果表明,敲除豬的CMAH基因和β4GalNT2基因能夠降低人、猴血清中的抗體結(jié)合含量,本次獲得的兩種基因敲除豬可為進一步降低異種器官移植急性排斥反應提供基礎研究材料。
【圖文】：

圖 1-1 異種移植是一種潛在的治療方法(Ekser et al., 2012)Fig.1-1 Disorders for which xenotransplantation is a potential therapy(Ekser et al., 2012)1.1.2 免疫排斥種類1.1.3.1 超急性排斥反應(Hyperacute rejection，HAR)經(jīng)過科學家們多年研究的發(fā)現(xiàn)，將異源的器官移植到人或者非靈長動物體內(nèi)，4

現(xiàn)階段臨床使用的治療患者糖尿病的胰島素均來自豬，說明使用豬胰島對進行治療是安全有效的。Windt 等人在 2009 年將表達 hCD46 的豬胰島細胞移植到糖尿病的食蟹猴體內(nèi)并在移植后使用免疫抑制劑，在不注射胰島素的情況下，移植作用時間超過了一年(Windt et al., 2009)。將經(jīng)藻酸鹽膠囊化的豬胰島細胞移植到糖非靈長類動物皮下后，胰島細胞可維持功能近 6 個月(Dufrane et al., 2010)。.1.5.2 心臟移植Kuwaki 和 Shimizu 等人分別在 2005 年和 2008 年發(fā)表了文章，文章表明，兩個研隊將敲除了 GGTA1 基因的豬心臟采用異位移植的方式植入狒狒的體內(nèi)，最長可維能 6 個月的時間(Kuwakietal.,2005；Shimizuetal.,2008)。此后，，在 2012 年，Mohiud在團隊將敲除 GGTA1 同時轉(zhuǎn)入人 CD46 基因的豬心臟進行移植，移植后器官受體時間長達 236 天(Mohiuddin et al., 2012)。除此之外，異種移植在肝臟、腎臟、小腸、肺移植等方面均已經(jīng)進行了大量工取得了一定進展(圖 1-2)。盡管在異種移植領域需要克服的困難還有很多，但隨著異官在受體體內(nèi)維持功能的時間不斷延長和諸多科研人員在異種移植研究中的通力，相信這一難題很快會被解決。異種器官移植解決人類器官短缺的難題指日可待。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S828

【參考文獻】

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1 夏國偉;異種移植研究進展[J];復旦學報(醫(yī)學科學版);2001年03期

本文編號：2606833