【摘要】：牦牛(Bos grunniens)主要生活在中國(guó)青藏高原地區(qū),是牧區(qū)人民的生產(chǎn)資料之一,但是其季節(jié)性發(fā)情和繁殖效率低的缺陷嚴(yán)重影響了牧區(qū)的經(jīng)濟(jì)收入。近年來(lái),為改善這一現(xiàn)狀,關(guān)于牦牛生殖生理方面開(kāi)展了大量的研究,發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量直接影響受精后胚胎移植、發(fā)育、妊娠率以及犢牛的成活率。已有相關(guān)報(bào)道表明,組蛋白去甲基化酶調(diào)控了卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程,且KDM1A在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過(guò)程的表達(dá)水平呈動(dòng)態(tài)變化。但是,KDM1A是如何調(diào)控牦牛卵母細(xì)胞成熟的尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究通過(guò)克隆獲得牦牛KDM1A基因序列,并分析其生物信息學(xué)和組織表達(dá)譜,利用KDM1A特異性抑制劑GSK-KDM1A,初步探索KDM1A在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的功能作用,結(jié)果如下:1.克隆得到牦牛KDM1A基因2 401 bp的cDNA序列。同源性結(jié)果表明,該基因在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。對(duì)其組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),其在牦牛體內(nèi)廣譜表達(dá),特別是卵巢、睪丸中表達(dá)量較高,推測(cè)其在牦牛繁殖生理活動(dòng)中起一定作用;2.免疫組化結(jié)果顯示,KDM1A在牦牛卵巢顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞中均有表達(dá);RT-qPCR結(jié)果顯示,KDM1A在卵母細(xì)胞中的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)分布,其中MⅠ期表達(dá)水平極顯著低于MⅡ和GV期(P0.01),GV期KDM1A的表達(dá)水平和MⅡ期該基因的表達(dá)差異不顯著(P0.05),表明KDM1A參與了牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程;3.在卵母細(xì)胞成熟液中添加不同濃度GSK-KDM1A,探究其對(duì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展程度,卵母細(xì)胞成熟率及受精后胚胎發(fā)育潛能的影響。結(jié)果顯示,牦牛COCs在添加了不同濃度抑制劑培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h后,160 nM和320 nM GSK-KDM1A處理組的卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散值、卵母細(xì)胞成熟率以及卵裂率均顯著低于對(duì)照組(P0.05);各組囊胚的形成率無(wú)顯著差異(P0.05);隨后檢測(cè)不同濃度GSK-KDM1A對(duì)胚胎干性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,抑制KDM1A表達(dá)將上調(diào)OCT4、SOX2的表達(dá)(P0.05),而NANOG的表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05),表明牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟受KDM1A調(diào)控,且下調(diào)該基因的表達(dá)會(huì)顯著降低卵母細(xì)胞成熟及胚胎的發(fā)育潛力;綜上,本試驗(yàn)成功獲得了牦牛KDM1A的基因序列,其在進(jìn)化過(guò)程中高度保守;在牦牛體內(nèi)廣譜表達(dá),尤其是在卵巢和睪丸器官中,表明其與牦牛的生殖生理密切相關(guān)。通過(guò)添加其特異性抑制劑,顯著影響牦牛卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟及胚胎的發(fā)育潛力,揭示KDM1A參與了牦牛卵母細(xì)胞的發(fā)育并起重要作用,但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此,本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究KDM1A功能及其在牦牛生殖生理過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.2 KDM1A 的催化反應(yīng)機(jī)理（阮建斌 等, 2008）Fig 1.2 The catalytic mechanism of KDM1A9.2.2 KDM1A 相關(guān)研究進(jìn)展KDM1A 在哺乳動(dòng)物組織中是普遍表達(dá)，，并且可通過(guò)抑制或激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控 DNA 損傷、還原轉(zhuǎn)錄子的活性以及紡錘體和染色體的缺失，進(jìn)而在多種生體的生殖細(xì)胞系中發(fā)揮重要作用(翟曜耀 等, 2012; Nottke et al., 2009; Wang et a2007; Kim et al., 2015; Wang et al., 2016; Lim et al., 2010)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)該基同樣參與了癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)、機(jī)體造血的調(diào)控以及性激素受體介導(dǎo)因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程(翟曜耀 等, 2012; Yeh et al., 2000; Huang et al., 2007; Tsai et a2008; Shao et al., 2008; Hu et al., 2009)，由此可知，KDM1A 基因在哺乳動(dòng)物生殖發(fā)調(diào)控、造血系統(tǒng)、多能干細(xì)胞的調(diào)控及內(nèi)分泌等相關(guān)生物學(xué)活動(dòng)的調(diào)節(jié)中均起重要用。9.2.2.1 與癌癥相關(guān)的研究

圖 2.1 牦牛 KDM1A 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig 2.1 Result for PCR amplification of yak KDM1Aer；1.第 1 段 PCR 產(chǎn)物；2.第 2 段 PCR 產(chǎn)物；3 第 3 段 Per; 1. First PCR product of yak KDM1A; 2. Second PCR prodof yak KDM1A1A 基因同源性比較及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建所得的牦牛 KDM1A 基因與黃牛(XM_0052033.2）、綿羊（XM_012152442.2）、山羊（XM_99567.1 ） 、 駱 駝 （ XM_010979844.1 ） 、 人 (KJ_.1 ） 、 貓 (XM_019836867.1) 、 馬 (XM_014737.1）、兔（XM_008265704.2）、原雞（XM_015297594.4）進(jìn)行比對(duì)，分別是 99.6%、99.7%、97.6%、93.0%、92.9%、93.0%、89.4%、89.5%、81.5%、77
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S823.85

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本文編號(hào)：2603521