【摘要】：牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是副黏病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬的成員,為有囊膜病毒,其基因組是負(fù)鏈RNA,全長(zhǎng)約15000 nt,可轉(zhuǎn)錄出10條病毒RNA,并翻譯成11種蛋白質(zhì),其中9種為結(jié)構(gòu)蛋白、2種為非結(jié)構(gòu)蛋白。BRSV呈世界性分布,在我國(guó)的流行也比較普遍。BRSV感染牛如果繼發(fā)性細(xì)菌感染,呼吸系統(tǒng)疾病會(huì)更加復(fù)雜,是發(fā)病牛高度死亡的主要原因,給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫仍是防控該病的有力手段�；诜聪蜻z傳技術(shù)的病毒基因結(jié)構(gòu)與功能的研究,是揭示BRSV致病機(jī)理、免疫保護(hù)機(jī)制以及病毒的宿主和組織嗜性等相關(guān)研究的基礎(chǔ)。本研究以BRSV核酸呈陽(yáng)性的鼻拭子樣品LJX31為材料,對(duì)BRSV全長(zhǎng)基因組進(jìn)行序列測(cè)定,并進(jìn)行序列同源性及進(jìn)化樹(shù)分析,以確定中國(guó)流行的BRSV的遺傳進(jìn)化關(guān)系。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建BRSV反向遺傳質(zhì)粒系統(tǒng),可用于BRSV反向遺傳系統(tǒng)的建立,為BRSV的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ)。全長(zhǎng)基因組序列測(cè)定和分析結(jié)果顯示,LJX31全長(zhǎng)基因組為15150 nt,5’端非編碼區(qū)為45 nt,3’端非編碼區(qū)為161 nt�；蚪M的編碼區(qū)位于46-14989 nt,包括NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因。L基因最大,含有6573 nt;NS2基因最小,含有492 nt;NS1、N、P、M、SH、G、F和M2基因全長(zhǎng)依次為527、492、1202、869、950、466、840、1902和960 nt。全長(zhǎng)基因組序列比對(duì)分析顯示,LJX31與美國(guó)Atue51908株的同源性為96.4%。LJX31的全長(zhǎng)基因組存在13個(gè)核苷酸的插入和3個(gè)核苷酸的缺失。與Atue51908株相比,NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因的同源性為92.1-98.5%。對(duì)G蛋白的編碼基因序列進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析顯示,LJX31與美國(guó)毒株V41的同源性最高、親緣關(guān)系最近,同源性達(dá)95.1%,表明LJX31可能來(lái)源于美國(guó)。為構(gòu)建BRSV LJX31的反向遺傳操作系統(tǒng),分別構(gòu)建了基因組全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒,以及N、P、L和M2-1蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒;同時(shí),為了增加拯救病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性,本研究構(gòu)建了BRSV受體蛋白CX3CR1的真核表達(dá)質(zhì)粒。N、P、L、M2-1和CX3CR1這5個(gè)蛋白表達(dá)質(zhì)粒作為輔助質(zhì)粒,與全長(zhǎng)基因組cDNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BRSV易感細(xì)胞,可進(jìn)行病毒的拯救。本研究同時(shí)構(gòu)建了基于T7啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子的全長(zhǎng)基因組cDNA質(zhì)粒PVK-LJX31和PCI-LJX31;N、P和M2-1蛋白的編碼基因直接克隆至PCI-neo載體,分別構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1;L蛋白的編碼基因經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后克隆至p3xflag-CMV載體,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p3xflag-YH-L;CX3CR1蛋白的編碼基因采用PCR方法從牛的肺組織中擴(kuò)增獲得,直接克隆至PCI載體,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PCI-CX3CR1。PVK-LJX31、PCI-LJX31、PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L和PCI-CX3CR1,經(jīng)酶切和序列分析確定序列正確,這樣BRSV LJX31反向遺傳系統(tǒng)所需的遺傳元件均獲得了相應(yīng)的重組質(zhì)粒。采用IFA對(duì)PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證,結(jié)果顯示每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物均能與相應(yīng)的抗體發(fā)生反應(yīng),表明質(zhì)粒均能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得表達(dá)。此外,通過(guò)微基因組質(zhì)粒pok(-T7)-W對(duì)LJX31基因組的順式作用元件和調(diào)控區(qū)以及PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四個(gè)輔助質(zhì)粒的功能進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,pok(-T7)-W質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,再用BRSV感染細(xì)胞,可在細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白,表明LJX31基因組的順式作用元件和調(diào)控區(qū)是有功能的;而pok(-T7)-W質(zhì)粒和PCI-N、PCI-P、PCI-M2-1和PCI-YH-L四個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),卻不能夠在細(xì)胞中觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),表明PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四個(gè)輔助質(zhì)粒形成RNP復(fù)合物的能力、或者RNP復(fù)合物的功能有缺陷。綜上所述,本研究對(duì)BRSV LJX31的全長(zhǎng)基因組序列進(jìn)行測(cè)定及分析,并構(gòu)建了該毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的遺傳元件,包括基因組質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒及其功能鑒定的方法,為BRSV反向遺傳平臺(tái)的建立打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 牛呼吸道合胞體病毒反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建的基礎(chǔ)研究2.1.7 輔助質(zhì)粒的構(gòu)建BRSV 拯救所必需的輔助質(zhì)粒包括 N、P、L 和 M2-1 四個(gè)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，此外為了增加拯救病毒的細(xì)胞適應(yīng)性，本研究增加了一個(gè)BRSV受體CX3CR1的表達(dá)質(zhì)粒作為輔助質(zhì)粒之一。根據(jù)測(cè)定的 LJX31 基因組全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物（表 2-4），，通過(guò) PCR 的方式擴(kuò)增 N、P 和 M2-1 三個(gè)蛋白編碼基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），并分別克隆至真核表達(dá)載體 PCI-neo-的 CMV 啟動(dòng)子下游，分別命名為 PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1（圖 2-1）。利用天根公司的 DNA 提取試劑盒，從牛肺組織中獲得牛的基因組 DNA。設(shè)計(jì)引物（表 2-4）從牛的基因組 DNA 中擴(kuò)增編碼受體蛋白 CX3CR1 的 ORF。將 CX3CR1 的 ORF 克隆至真核表達(dá)載體 PCI 的 CMV 啟動(dòng)子下游（圖 2-1）。將構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為 PCI-CX3CR1。

表 2-5 p3xflag-YH-L 構(gòu)建所使用的引物Table2-5 Primers used for the construction of p3xflag-YH-因片段 Primer sequence（5’-3-YH-1ACGACTCACTATAGGCAGCCAAGAGAACAGG-YH-2CAGTCCCTGTTCTCTTGGGTTCAGCTTGCAGAT-YH-3CCGACATCTGCAAGCTGGTCGACTCTAGAGG質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒以及全長(zhǎng)基因組順式作用原件和調(diào)控區(qū)序列的功基因組由 LJX31 基因組的 5’NTR、3’NTR 以及完整 圖 2-2 p3xflag-YH-L 構(gòu)建示意圖ig.2-2 Schematic representation for the construction of p3xflag-Y
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.653

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本文編號(hào)：2602603