【摘要】：鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動物附屬器官,對鹿茸進行基礎(chǔ)研究,不僅為研究器官再生提供了科學(xué)參考,也為實踐生產(chǎn)提供一定的科學(xué)理論基礎(chǔ)。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)具有抑制血管生成以及在骨的形成和骨化中扮演重要的作用。在鹿茸內(nèi),PEDF廣泛分布于鹿茸各個組織層中并涉及鹿茸中表皮、真皮、軟骨、骨、血管和神經(jīng)的高速增殖與分化。然而,PEDF在鹿茸內(nèi)促進鹿茸細胞增殖和分化的具體機制尚不清楚。因此,本課題以鹿茸細胞(間充質(zhì)細胞、前成軟骨細胞、軟骨細胞)為研究對象,利用RNAi干擾等技術(shù)手段探討PEDF在鹿茸細胞生長發(fā)育過程中的作用及機制。主要研究結(jié)果如下:間充質(zhì)細胞(mesenchyme,MSCs)、前成軟骨細胞(Pre-cartilage,QCs)和軟骨細胞(Cartilage,RCs)(1)PEDF受體LR干擾效果檢測:定量和Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組LR基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達量均顯著下調(diào)(p0.05),其中間充質(zhì)細胞(mesenchyme,MSCs)下調(diào)68.02%,前成軟骨細胞(Pre-cartilage,QCs)下調(diào)93.3%,軟骨細胞(Cartilage,RCs)下調(diào)60.25%,說明siRNA干擾效果明顯(p0.05)。(2)PEDF調(diào)控了細胞周期:與對照組相比,干擾LR(siLR)組三種細胞S期均顯著下調(diào)(p0.05),PEDF處理組S期除MSCs外均顯著上調(diào)(p0.05);定量和Western blot結(jié)果顯示PEDF可顯著上調(diào)除MSCs外的鹿茸細胞內(nèi)CyclinD1的表達(p0.05)。(3)PEDF促進鹿茸細胞的增殖:CCK-8的實驗結(jié)果顯示三種細胞中干擾LR(siLR)組,其細胞活力顯著下調(diào)(p0.05),PEDF處理組顯著均上調(diào)(p0.05)。定量和Western blot結(jié)果顯示PEDF可顯著上調(diào)鹿茸細胞中PCNA的表達(p0.05)。(4)PEDF上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達:從mRNA水平和蛋白水平VEGF的表達量情況,三種細胞內(nèi)干擾LR(siLR)組VEGF的表達量均顯著下調(diào)(p0.05)。PEDF處理鹿茸細胞后,VEGF的表達量均顯著上調(diào)(p0.05)。(5)PEDF調(diào)控鹿茸細胞的生長通過ERK1/2信號通路:RCs中,WB結(jié)果顯示,干擾LR(siLR)組,ERK1/2的表達顯著下調(diào)(p0.05),但PEDF單獨處理則無顯著影響。MSCs中,干擾LR(siLR)組,ERK1/2的表達上調(diào)(p0.05),PEDF單獨處理后反而下調(diào)(p0.05)。QCs中,干擾LR(siLR)組,ERK1/2表達顯著下調(diào)(p0.05),PEDF單獨處理后ERK1/2表達顯著上調(diào)(p0.05)。本實驗結(jié)果表明:PEDF具有促進鹿茸細胞增殖和周期的作用,干擾PEDF在鹿茸中起主要作用的受體LR后,細胞的活力均顯著下調(diào),周期均受到阻礙,并可顯著抑制VEGF的表達。在鹿茸生長發(fā)育過程中,PEDF可促進VEGF的表達進而調(diào)控血管生成。
【圖文】：

圖 1-1 鹿茸頂端增殖區(qū)各層細胞的分布位置 真皮層；P: 軟骨膜；M:間充質(zhì)層；PC：前成軟骨層；骨層he location of each cells in the top proliferation area o: Dermis; P: Perichondrium; M: Reserve mesenchyme（M（QCs）; TZ: Transition zone; C: Cartilage（RCs）質(zhì)層作為一種多功能干細胞，最初由 Friedenstein 和向分化成軟骨細胞和成骨細胞的能力(Friedens做了諸多研究，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細胞可從多種組織和臍帶血等，且都具有分化的潛能(Boyd et al 2國際細胞治療協(xié)會建議將分離卻未純化的貼壁

PEDF 對鹿茸不同細胞增殖的作用及機制研究驗結(jié)果 鹿茸細胞的鑒定將分層培養(yǎng)獲取并凍存的鹿茸細胞（MSCs，QCs，RCs）從液氮中取出，傳 2 代后分別用甲苯胺藍、茜素紅 S 和阿利新藍染色。鹿茸間充質(zhì)細胞細現(xiàn)長梭形，甲苯胺藍染色無異染，細質(zhì)和胞核染色后均呈現(xiàn)藍色；茜素紅細胞無陽性反應(yīng)，阿利新藍染色胞質(zhì)無藍染，只有細胞核藍染（如圖 a）骨與間充質(zhì)細胞相比細胞體積較大，，呈長橢圓形，細胞核偏離細胞中央，染色部分細胞出現(xiàn)異染，茜素紅 S 染色胞質(zhì)內(nèi)有微弱陽性反應(yīng)，阿利新藍出現(xiàn)藍染，胞核無藍染（如圖 b）。軟骨細胞細胞形態(tài)和核膜都不規(guī)則（，甲苯胺藍染色，胞質(zhì)有紫紅色異染現(xiàn)象，茜素紅 S 染色有明顯的紅色鈣新藍染色，胞質(zhì)胞核均被藍染（如圖 c）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S825

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本文編號：2600648