【摘要】：骨骼肌是畜禽肉類食品的重要組成部分,其肌纖維類型組成是影響肉品質(zhì)的重要因素。因此,研究骨骼肌發(fā)育對于如何提高肉產(chǎn)量以及改善肉品質(zhì)具有一定的指導意義。至今,有關骨骼肌形成過程的研究已有大量的報道。骨骼肌發(fā)育始于胚胎期,由中胚層的體節(jié)遷移出Pax3~+/Pax7~+肌源性祖細胞,由生肌調(diào)節(jié)因子Myf5、MyoD以及MRF4參與調(diào)控的成肌定向分化,肌細胞進一步經(jīng)過增殖、分化融合形成肌纖維;在出生后,肌纖維數(shù)目基本確定,肌肉量的增加主要依賴肌纖維的增長和增粗。當骨骼肌受到損傷刺激或者運動時,骨骼肌具備再生修復能力,而這種能力主要依靠肌源性干細胞(衛(wèi)星細胞,Pax7~+/Myf5~-)的激活,激活后的衛(wèi)星細胞(Pax7~+/Myf5~+)可以向成肌進行分化,融合形成新的肌纖維,達到修復受傷肌纖維的目的。無論是胚胎階段的骨骼肌形成,還是出生后骨骼肌的生長甚至損傷后的再生修復過程,除受到Pax3/Pax7,MRFs的調(diào)控外,還受到MEF2家族成員,Wnt等信號分子,IGFs等生長因子以及非編碼RNA的調(diào)控。近年來,有關非編碼RNA調(diào)控骨骼肌的發(fā)育的研究備受關注,其重要性不容忽視。本論文的研究重點在于運用高通量測序技術篩選秦川牛不同發(fā)育階段(胚胎期、出生期以及成年階段)骨骼肌差異表達的非編碼RNA(lncRNAs和miRNAs),通過5’RACE和3’RACE、RT-qPCR、FISH、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、RNA pull down、流式細胞術等技術,系統(tǒng)闡釋源于生長因子IGF2基因內(nèi)含子區(qū)域的非編碼RNA IGF2 AS和miR-483在牛骨骼肌發(fā)育中的功能和分子機制。主要研究結(jié)果如下:1、肌肉組織中l(wèi)ncRNAs的篩選、鑒定及表達特征分析本研究在實驗室前期秦川牛不同發(fā)育階段(胚胎期、出生后和成年階段)骨骼肌lncRNA高通量測序的基礎之上,進一步對已篩選的401個差異表達的lncRNA進行挖掘鑒定分析。發(fā)現(xiàn)在生長因子IGF2基因內(nèi)含子區(qū)域存在一個反義轉(zhuǎn)錄本,將其命名為IGF2 antisense transcript(IGF2 AS)。通過cDNA末端快速擴增(RACE),發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)錄本由698個核苷酸的單外顯子組成。經(jīng)蛋白編碼潛能軟件CPC預測分析發(fā)現(xiàn),IGF2AS的編碼能力較弱,屬于非編碼RNA。高通量測序結(jié)果和RT-qPCR驗證結(jié)果都證實,IGF2 AS主要在胚胎階段的骨骼肌中表達。在牛骨骼肌細胞生長階段,IGF2 AS表達量相對較高;在分化時期,IGF2 AS的表達呈現(xiàn)出上升的趨勢。2、IGF2 AS調(diào)控牛骨骼肌細胞增殖、分化和凋亡的功能研究運用RT-qPCR、Western blot、流式細胞術、EdU、CCK8、RNA-seq、細胞免疫熒光等試驗揭示IGF2 AS在牛骨骼肌發(fā)育過程中的功能。在牛骨骼肌細胞增殖階段,干擾IGF2 AS表達抑制細胞增殖關鍵基因的表達水平,導致G_1期細胞數(shù)目增加,S期細胞減少,細胞增殖活性下降,而過表達IGF2 AS后結(jié)果與之相反;在牛骨骼肌細胞分化階段,干擾IGF2 AS抑制生肌調(diào)控因子的表達水平,MyHC陽性肌管的數(shù)目減少,而過表達IGF2 AS后結(jié)果與之相反;另外,干擾IGF2 AS導致牛骨骼肌細胞生長階段凋亡細胞數(shù)目的增加,而過表達IGF2 AS抑制牛骨骼肌細胞的凋亡。3、IGF2 AS調(diào)控牛骨骼肌細胞增殖、分化和凋亡的機制研究RNA核質(zhì)分離和熒光原位雜交實驗結(jié)果表明,IGF2 AS在牛骨骼肌細胞的細胞質(zhì)和細胞核中都表達。經(jīng)DNaseⅠ和RNase A處理細胞總RNA后,PCR檢測結(jié)果表明IGF2AS與IGF2 mRNA的前體序列可形成互補雙鏈結(jié)構(gòu)。放線菌素D處理生長階段的牛骨骼肌細胞發(fā)現(xiàn),IGF2 AS的表達能夠穩(wěn)定IGF2不同轉(zhuǎn)錄本的表達。RIP分析結(jié)果表明,Ago-2蛋白質(zhì)可與IGF2 AS結(jié)合,推測IGF2 AS具有競爭性內(nèi)源RNA的潛質(zhì)。雙熒光素酶報告分析結(jié)果表明,miR-221/miR-222與IGF2 AS存在競爭性結(jié)合關系,進一步的功能驗證結(jié)果表明過表達IGF2 AS能夠恢復miR-221/miR-222靶基因MyoD的表達。RNA pull down、蛋白質(zhì)譜以及RIP檢測結(jié)果表明,蛋白質(zhì)ILF3可與IGF2 AS結(jié)合。IGF2AS正調(diào)控ILF3的表達,干擾ILF3后抑制牛骨骼肌細胞增殖和分化,促進牛骨骼肌細胞凋亡。4、miR-483通過IGF1/PI3K/Akt信號通路調(diào)控牛骨骼肌細胞增殖和分化MicroRNA高通量測序分析結(jié)果表明,位于IGF2基因內(nèi)含子區(qū)域的miR-483在不同發(fā)育階段的骨骼肌中差異表達,且在胚胎期表達量較高。功能研究結(jié)果表明,過表達miR-483抑制牛骨骼肌細胞的增殖和分化,干擾miR-483促進牛骨骼肌細胞的增殖和分化。機制研究表明,IGF1是miR-483的一個靶基因,并且miR-483可以通過下調(diào)IGF1的表達,影響PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白的表達。本研究借助高通量測序技術篩選差異表達的lncRNA和microRNA,闡明lncRNA和microRNA在牛骨骼肌發(fā)育過程中的功能和作用機制,為研究非編碼RNA調(diào)控牛骨骼肌發(fā)育提供理論基礎。
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Shh、BMP 和 Notch 等，以及生長因子 TGF-β、FGFs 和 IGFs 等的影響。另外，非編碼 RNA（miRNA 和 lncRNA）也廣泛參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育過程。出生后，肌肉量的增加主要依賴于骨骼肌纖維的增長和增粗，這得益于肌源性干細胞（衛(wèi)星細胞）的存在。骨骼肌是可以再生的，這種能力正是由衛(wèi)星細胞所賦予的在正常狀態(tài)下，衛(wèi)星細胞處于靜息狀態(tài)，當骨骼肌運動或受到損傷刺激時，衛(wèi)星細胞由靜息狀態(tài)變成激活狀態(tài)，定向分化成成肌細胞，經(jīng)過增殖、分化融合形成肌管修復受傷的肌纖維，從而達到修復損傷骨骼肌的目的。整個過程也受到上述 Pax3/Pax7、MRFs、MEF2、信號分子、生長因子以及非編碼 RNA 等因素的調(diào)控。骨骼肌損傷再生修復過程類似于胚胎階段骨骼肌發(fā)育，這為在體研究骨骼肌發(fā)育過程提供了有利條件1.1.1 生肌調(diào)控因子在骨骼肌形成過程中的作用生肌調(diào)控因子（MRFs）由 MyoD、Myf5、myogenin 和 MRF4 四個成員組成，都具備基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性（圖 1-1）。在胚胎階段骨骼肌生成和出生后骨骼肌發(fā)育的過程中，MRFs 參與調(diào)控骨骼肌的定向和分化(Hernandez-Hernandez et al. 2017)。通過調(diào)節(jié)肌節(jié)和肌肉特異性基因的活化以促進細胞分化和肌節(jié)的組裝，它們在多個點起協(xié)同作用以建立骨骼肌表型。

第一章 動物骨骼肌發(fā)育及其非編碼 RNA 調(diào)控研究進展in 下調(diào)，說明在分化過程中 myogenin 作為重要的細胞周期退出調(diào)節(jié)因MyoD 能夠促進生長成肌細胞的增殖(Cao et al. 2006)。在 C2C12 成肌eq 實驗證明，MyoD 和 Myf5 之間的差異依賴于轉(zhuǎn)錄活性而不是整個基點的偏好，只有 MyoD 能夠富集 RNA polⅡ并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，而 M蛋白 H4 乙�；揎椚旧w卻不能富集 RNA polⅡ，從而造成二者在調(diào)( Hernandez-Hernandez et al. 2017; Cao et al. 2010)。由此可見，MRFs 調(diào)僅有來自上游調(diào)控因子的參與，，其涉及調(diào)控的下游靶基因更是復雜多樣
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823

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相關博士學位論文 前1條

1 宋成創(chuàng);IGF2基因來源的IGF2 AS和miR-483調(diào)控牛骨骼肌細胞增殖分化機制研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

本文編號：2600495