【摘要】：弓形蟲病(Toxoplasmsis)是由弓形蟲(Toxoplasma gondii,T.gondii)引起的食源性人獸共患寄生蟲病。弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲,其宿主廣泛且生活史較復雜。作為機會性致病寄生蟲,弓形蟲能夠使免疫缺陷患者表現(xiàn)出弓形蟲病癥狀,甚至死亡。全球約1/3的人口受弓形蟲威脅;弓形蟲也能夠引起動物爆發(fā)弓形蟲病,豬急性感染弓形蟲死亡率可達60%。總之,弓形蟲病嚴重威脅著人和動物的健康,并給畜牧業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。弓形蟲入侵相關蛋白質在弓形蟲入侵過程中發(fā)揮著關鍵作用,主要參與黏附宿主細胞、形成移動連接、形成和修飾納蟲空泡及調節(jié)宿主轉錄等過程。黏附是弓形蟲入侵的第一步,弓形蟲表面抗原和分泌蛋白質與宿主細胞表面受體互作,促進蟲體入侵宿主細胞。硫化肝素(Heparan sulfate,HS)為廣泛分布于脊椎動物細胞表面的無支鏈多糖,弓形蟲入侵相關蛋白質與肝素/HS結合的研究相對較少。弓形蟲入侵宿主細胞的分子機制尚不清晰,且弓形蟲入侵相關的肝素結合蛋白質在入侵過程中行使的功能也尚未有全面報道。因此,研究弓形蟲入侵相關的肝素結合蛋白質的功能,將為進一步闡明弓形蟲入侵宿主細胞的分子機制奠定基礎。本課題對與肝素結合的弓形蟲入侵相關的棒狀體蛋白質9(ROP9)、微線體蛋白質3(MIC3)和表面抗原2(SAG2)進行功能研究,不僅為揭示肝素在弓形蟲入侵過程中的作用機制奠定基礎,同時也為研制弓形蟲新型疫苗和藥物靶標提供理論依據(jù)。本研究通過對編碼ROP9、MIC3和SAG2的氨基酸進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)此三種蛋白質在弓形蟲種內(nèi)均具有較高的保守性,且均具有良好的B細胞表位,表明其可能是弓形蟲的較重要蛋白質且具有弓形蟲疫苗和診斷候選抗原的潛力。為了對弓形蟲入侵相關蛋白質進行功能分析,本研究利用原核表達載體分別表達和純化了His標簽和GST標簽重組蛋白質,并成功制備了特異性多克隆抗體。利用實時熒光定量PCR(Quantitive real-time PCR,RT-PCR)和Western blot對目的基因的轉錄水平和表達水平分析,結果發(fā)現(xiàn),在弓形蟲RH株中,ROP9、MIC3和SAG2的轉錄和表達水平在體外均高于體內(nèi)。通過間接免疫熒光試驗(Indirect immunofluorescence assay,IFA)對蛋白質在弓形蟲入侵宿主細胞過程中的表達量進行分析,發(fā)現(xiàn)ROP9、MIC3和SAG2蛋白質在入侵的過程中的表達量明顯高于游離蟲體的表達量。通過肝素結合、競爭抑制及細胞黏附實驗,證明了ROP9、MIC3和SAG2蛋白質能夠與肝素特異性結合并黏附于宿主細胞表面。為了進一步研究封閉弓形蟲或宿主細胞表面的入侵位點對蟲體入侵力的影響,進行了外源肝素、蛋白質和抗體抑制蟲體入侵分析,結果表明,外源肝素可以阻斷弓形蟲的入侵,且蛋白質MIC3、SAG2和ROP9與其高濃度的特異性多克隆抗體均可抑制T.gondii RH株蟲體入侵宿主細胞。通過感染弓形蟲的人血清識別蛋白質實驗和蛋白質的免疫保護實驗驗證MIC3、SAG2和ROP9免疫識別的特性,結果提示蛋白質ROP9、MIC3和SAG2均能被免疫識別,且對BALB/c小鼠有部分的免疫保護效果。為進一步探索ROP9蛋白質對弓形蟲的入侵力和毒力相關性的影響,本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了弓形蟲ROP9基因敲除株(RH△ROP9)和補回株(RH-Re ROP9),并通過入侵率、增殖率、胞出時間和對小鼠的致病性分析,結果發(fā)現(xiàn),弓形蟲ROP9基因敲除株入侵宿主細胞的速率明顯下降,且對小鼠的致病性減弱。目前尚未有能完全預防和控制弓形蟲病的疫苗和藥物,因此,急需研發(fā)安全且有效的新型弓形蟲疫苗。本研究利用已篩選出的編碼弓形蟲入侵相關的肝素結合蛋白質的基因進行構建重組腺病毒,并對其進行免疫原性分析。分別將弓形蟲ROP9、MIC3和SAG2基因克隆至腺病毒穿梭載體,并將其與腺病骨架載體進行共轉染HEK293A細胞,通過熒光顯微鏡觀察和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),成功包裝出了表達目的蛋白質的重組腺病毒。將包裝出的重組腺病毒分別免疫BALB/c小鼠并進行免疫原性分析,結果顯示,免疫小鼠獲得較高的特異性的抗弓形蟲Ig G;重組腺病毒組小鼠血清中的IFN-γ、TNF-α及IL-6等Th1型細胞因子顯著或極顯著高于對照組(P0.05、P0.01或P0.001);二價或三價重組腺病毒組小鼠脾臟中活化的CD4+和CD8+T淋巴細胞顯著或極顯著高于對照組(P0.05、P0.01或P0.001);且免疫小鼠的存活率及存活時間極顯著增加(P0.01或P0.001)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲入侵相關蛋白質ROP9、MIC3和SAG2能夠與肝素特異性結合,并與宿主細胞發(fā)生黏附;弓形蟲ROP9蛋白質參與弓形蟲的入侵,且是弓形蟲的一個毒力因子;重組腺病毒免疫小鼠,能夠激起小鼠的體液免疫和細胞免疫,且對小鼠有部分的免疫保護作用。該研究結果不僅為闡明弓形蟲入侵宿主細胞的分子機制奠定基礎,也為研發(fā)新型弓形蟲疫苗提供新思路。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.7

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