發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 16:43

【摘要】：雞球蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的寄生原蟲(chóng)病,該病的防治主要采用在飼料中添加化學(xué)藥物和疫苗免疫預(yù)防兩種方法。目前在臨床上應(yīng)用的雞球蟲(chóng)病疫苗包括活疫苗和亞單位疫苗兩大類(lèi)�；钜呙缬职ǘ疽呙绾腿醵疽呙鐑纱箢�(lèi),由于弱毒疫苗的蟲(chóng)株毒力低,免疫后不引起不良反應(yīng)或反應(yīng)輕,所以更受養(yǎng)殖戶青睞。亞單位疫苗的生產(chǎn)需從感染的雞體內(nèi)分離純化配子體,然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白,因此生產(chǎn)費(fèi)時(shí)、成本昂貴。利用基因重組技術(shù)研制基因工程疫苗可能解決這一難題。毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria necatrix)是雞球蟲(chóng)病的重要病原,在臨床上常危害8～18周齡的雞,引起雞的急性小腸球蟲(chóng)病。近年來(lái),在我國(guó)隨著生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)的黃羽雞飼養(yǎng)數(shù)量的不斷攀升,以及采用地面平養(yǎng)方式,使得由毒害艾美耳球蟲(chóng)引起的球蟲(chóng)病呈上升趨勢(shì),給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。為此,本研究采用早熟選育的方法培育毒害艾美耳球蟲(chóng)減毒株,同時(shí)應(yīng)用基因工程技術(shù)原核表達(dá)毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白Engam59基因,純化表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn),評(píng)價(jià)重組配子體抗原的免疫保護(hù)力以及早熟株的免疫原性,旨在為雞球蟲(chóng)病減毒疫苗和基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。1毒害艾美耳球蟲(chóng)單卵囊蟲(chóng)株的建立其PCR鑒定分離毒害艾美耳球蟲(chóng)單個(gè)卵囊,感染3日齡無(wú)球蟲(chóng)雛雞,收集雞糞便中卵囊,培養(yǎng)孢子化后感染雛雞擴(kuò)增卵囊;卵囊孢子化后再感染無(wú)球蟲(chóng)雛雞,觀察腸道病變、蟲(chóng)體寄生部位以及卵囊形態(tài)。以4種雞球蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存株(毒害、巨型、柔嫩、堆型艾美耳球蟲(chóng))的基因組DNA為模板,分別用針對(duì)4種球蟲(chóng)的ITS-1序列設(shè)計(jì)的種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,觀察特異性條帶。根據(jù)腸道病變、蟲(chóng)體寄生部位和卵囊形態(tài)特征,鑒定單卵囊分離株為毒害艾美耳球蟲(chóng),其潛在期為156 h。PCR結(jié)果顯示,只有在模板和擴(kuò)增引物為同一種球蟲(chóng)時(shí),方能擴(kuò)增出特異性條帶,表明本室保存的4種雞球蟲(chóng)均為純種株。2毒害艾美耳球蟲(chóng)的早熟株選育以毒害艾美耳球蟲(chóng)單卵囊分離株為親本株,采用早熟株選育方法選育毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株。經(jīng)26代早熟選育后,再連續(xù)傳代2次,擴(kuò)增卵囊。擴(kuò)增卵囊培養(yǎng)孢子化后,以0.5 × 104、1 × 104、3 × 104、5 × 104個(gè)/羽的劑量感染14日齡雛雞,同時(shí)設(shè)親本株為對(duì)照組,以平均體重、死亡率和腸道病變記分為指標(biāo),評(píng)價(jià)早熟株的致病性。結(jié)果顯示,經(jīng)26代早熟選育后潛在期從156h縮短到140h,早熟株與親本株相比致病性明顯減弱。3毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體Engam59基因的原核表達(dá)根據(jù)Engam59基因的ORF序列和質(zhì)粒pET-28a(+)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-gam59為模板擴(kuò)增出表達(dá)片段,大小為1419 bp(已除掉信號(hào)肽部分)。將該基因片段與載體pET-28a(+)連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-gam59。重組質(zhì)粒pET-28a(+)-gam59轉(zhuǎn)化BL21,誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析顯示大小為57 kDa左右,Western blot分析顯示重組蛋白能被抗6 × HIS標(biāo)簽單抗特異性識(shí)別。可溶性分析顯示重組蛋白以包涵體存在。用純化的重組蛋白免疫小鼠制備多抗,以制備的抗重組蛋白鼠多抗為一抗,Western blot檢測(cè)毒害艾美耳球蟲(chóng)配子體蛋白,見(jiàn)有一大小為56kDa左右的特異性條帶。結(jié)果表明體外重組表達(dá)配子體蛋白rEnGAM59具有較好的免疫原性。4毒害艾美耳球蟲(chóng)重組配子體蛋白rEnGAM59的免疫保護(hù)效果以雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物,卵囊減少率、病變記分、平均增重等為指標(biāo),評(píng)價(jià)重組蛋白rEnGAM59的免疫保護(hù)效果,并檢測(cè)免疫后產(chǎn)生的特異性抗體水平。結(jié)果顯示,與未免疫攻蟲(chóng)組相比,重組蛋白rEnGAM59在一定程度上能降低卵囊產(chǎn)量與減輕病變記分,提高平均增重,但不能達(dá)到卵囊免疫組的免疫保護(hù)水平。早熟株卵囊免疫組與親本株卵囊免疫組的免疫保護(hù)效果相近,無(wú)顯著差異。
【圖文】：

３結(jié)果逡逑３．邋１單卵囊分離株的卵囊形態(tài)逡逑卵囊呈長(zhǎng)卵圓形，壁光滑，，無(wú)卵膜孔和卵囊殘?bào)w，有極體（圖１－１）。測(cè)１００個(gè)孢子逡逑化卵囊，大小為邋１２．５０邋￣邋３０．００邋ｐｍ邋ｘ邋１２．５０邋￣邋２２．５０邋（ａｍ，平均大小為邋１７．５０邋ｎｍ邋ｘ邋１４．５５逡逑形狀指數(shù)為１．２０。孢子囊呈長(zhǎng)卵圓形，有斯氏體，無(wú)孢子囊殘余體，測(cè)１００個(gè)孢子囊大小逡逑為邋９．００？１４．００叫１＞＜４．００？７．１０｜ａｍ，平均大小邋ｉａ９１（ａｍｘ５．９１ｐｍ，與文獻(xiàn)相符［１’５］。逡逑＿逡逑圖１－１毒害艾美耳球蟲(chóng)卵囊逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏｏｃｙｓｔｓ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｎｅｃａｔｒｉｘ逡逑３．邋２單卵囊分離株的潛在期逡逑攻蟲(chóng)后第５天開(kāi)始進(jìn)行糞檢，每隔２邋ｈ進(jìn)行一次。在１５６邋ｈ查見(jiàn)卵囊排出，故該毒害逡逑艾美耳球蟲(chóng)的潛在期為１５６小時(shí)。逡逑３．邋３單卵囊分離株的寄生部位和腸道病變逡逑剖檢感染雞，發(fā)現(xiàn)整個(gè)小腸，尤其是卵黃蒂前后，漿膜面可見(jiàn)針尖狀出血點(diǎn)，腸管明逡逑顯腫脹（圖１－２），打開(kāi)腸腔見(jiàn)腸內(nèi)容物混有較多血凝塊，腸黏膜脫落，刮取腸黏膜涂片逡逑鏡檢發(fā)現(xiàn)大量的巨型裂殖體，卵囊僅見(jiàn)于盲腸黏膜中。逡逑

ｃ：邋Ｅ．邋ｍａｘｉｍａ邋ｓｐｏｒａｔｅｄ邋ｏｏｃｙｓｔｓ；邋ｄ：邋Ｅ．邋ａｃｅｎ＾ｕｌｉｎａ邋ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄ邋ｏｏｃｙｓｔｓ逡逑３．邋３邋ＰＣＲ產(chǎn)物電泳檢測(cè)逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖１－４￣７。以毒害艾美耳球蟲(chóng)的ＤＮＡ為模板，分別用毒逡逑害、柔嫩、巨型和堆型艾美耳球蟲(chóng)的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，結(jié)果僅在用毒害艾美耳球蟲(chóng)引逡逑物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增的產(chǎn)物中見(jiàn)有特異性條帶，其他３種球蟲(chóng)的引物未能擴(kuò)增出條帶。而當(dāng)逡逑以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的ＤＮＡ模板時(shí)，用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增可見(jiàn)有特異性逡逑條帶（圖１－４）。逡逑以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的ＤＮＡ為模板，分別用柔嫩、巨型、堆型和毒害艾美耳球蟲(chóng)的引逡逑物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，結(jié)果僅在用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增的產(chǎn)物中見(jiàn)有特異性條逡逑帶，其他３種球蟲(chóng)的引物未能擴(kuò)增出條帶。而當(dāng)以毒害艾美耳球蟲(chóng)的ＤＮＡ模板時(shí)，用毒逡逑害艾美耳球蟲(chóng)引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增可見(jiàn)有特異性條帶（圖卜５）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.723

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本文編號(hào)：2595328