【摘要】：牦牛是地理分布非常有限的偶蹄動(dòng)物之一,也是高寒地區(qū)特有牛種,更是高原地區(qū)支柱產(chǎn)業(yè),當(dāng)?shù)啬撩竦闹饕?jīng)濟(jì)來源之一。高寒藏香豬是世界上高海拔地帶比較少見的小型豬種,亦是我國(guó)珍貴的、獨(dú)有的豬種。然而,寄生蟲病嚴(yán)重威脅著牦牛、藏豬的健康,也制約著牦牛、藏豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,某些人畜共患寄生蟲,更潛在威脅著人類的健康。近年來,牦牛頻發(fā)腹瀉病,至今尚不清楚導(dǎo)致牦牛腹瀉的具體病原。而寄生蟲所致的動(dòng)物腹瀉病,占所有腹瀉疾病的40%。故為摸清我國(guó)珍貴動(dòng)物(牦牛、藏豬)的常見原蟲流行狀態(tài);初步挖掘牦牛腹瀉的寄生蟲病原體;揭示牦牛、藏豬寄生蟲的分子特征、挖掘潛在的藥物靶基因。本研究開展了牦牛、藏豬常見原蟲的血清學(xué)調(diào)查;基于高通量測(cè)序的腹瀉牦牛寄生蟲病原調(diào)查;牦牛、藏豬寄生蟲的分子特征研究;藏豬肺線蟲線粒體基因組測(cè)序和分析,研究結(jié)果如下:1.我國(guó)高原牦牛、藏豬常見原蟲血清學(xué)調(diào)查通過IHA或ELISA的檢測(cè)方法對(duì)在采自我國(guó)高海拔地區(qū)的四個(gè)省份(西藏、青海、四川、甘肅)的3582份牦牛血清(2011-2017),開展了牦牛七種寄生蟲(弓形蟲、犬新孢子蟲、泰勒蟲、巴貝斯蟲、棘球蚴、貝諾孢子蟲、住肉孢子蟲)的血清學(xué)檢測(cè)。應(yīng)用ELISA法對(duì)2016年采自西藏地區(qū)的454份藏豬血清進(jìn)行了棘球蚴血清學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明牦牛這七種寄生蟲的總體陽(yáng)性率分別為25.0%、6.3%、15.1%、21.5%、6.5%、1.1%、0.9%;藏豬棘球蚴陽(yáng)性率為7.3%。2.我國(guó)牦牛、藏豬五種寄生蟲線粒體基因擴(kuò)增及序列分析本研究以在我國(guó)西藏地區(qū)某屠宰場(chǎng)收集的藏豬肺線蟲、結(jié)節(jié)線蟲、蛔蟲、包蟲的包囊及在四川紅原地區(qū)采集的牦�；紫x為主要研究對(duì)象。通過對(duì)寄生蟲蟲體的線粒體分子標(biāo)記進(jìn)行基因克隆、序列純化、基因測(cè)序。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAMAN、Mega等,分別對(duì)這五種寄生蟲的9種線粒體基因進(jìn)行了多序列比對(duì)和進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染我國(guó)藏豬的肺線蟲為復(fù)陰后圓線蟲,其中米林縣、林芝縣及工布江達(dá)縣藏豬源復(fù)陰后圓線蟲與澳大利亞野豬源復(fù)陰后圓線蟲(NC_013813.1)同源性為97.5%-97.7%。感染藏豬的結(jié)節(jié)線蟲為三種混合感染(齒食道口線蟲、長(zhǎng)尾腸結(jié)節(jié)蟲、猩猩管口線蟲)。其中猩猩管口線蟲為首次在豬上發(fā)現(xiàn)。將從藏香豬胃和結(jié)腸分離的猩猩管口線蟲與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn),其與猩猩管口線蟲(AJ619979.1)同源性分別為89%和90%�；趎ad1、cox3和ITS三種分子標(biāo)記基因,發(fā)現(xiàn)藏豬胃、盲腸、結(jié)腸的線蟲陽(yáng)性率分別為81.13%、66.04%和77.36%。藏豬蛔蟲與豬蛔蟲(日本、我國(guó)湛江)分離株的同源性為98.4%-99.9%,與人蛔蟲(日本、巴西、我國(guó)臨沭)分離株的同源性為99.4%-99.7%。藏豬包蟲線粒體cox1基因與包蟲G4型(AF346403.11)高度同源,說明感染藏豬的包蟲為G4型。藏豬包蟲線粒體atp6基因與包蟲G6型(AY056613.1)同源性較高,說明感染藏豬的包蟲為包蟲G6型。感染牦牛的蛔蟲為牛弓首蛔蟲,且與牛弓首蛔蟲(AJ937266.1)同源性為99.7%。3.腹瀉牦牛寄生蟲病原調(diào)查本研究從我國(guó)甘南地區(qū),采集了健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便樣品,通過提取糞便微生物基因組DNA(g DNA)和進(jìn)行18S SSU r DNA序列擴(kuò)增,應(yīng)用高通量測(cè)序法,全面分析了健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便寄生蟲的多樣性與差異性。結(jié)果表明,在門水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便均檢測(cè)到線蟲門和頂復(fù)亞門。其中三組牦牛在線蟲門上,無顯著差異性(p0.05);而在頂復(fù)亞門上,腹瀉犢牦牛顯著高于腹瀉成年牦牛(p0.05)。在綱水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛的糞便均檢測(cè)到側(cè)口綱、色矛綱和Gregarinasina(頂復(fù)亞門的一個(gè)綱),而僅有腹瀉犢牦牛檢測(cè)到旋毛綱和纖毛蟲綱,但健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛,在這5種綱水平上均未發(fā)現(xiàn)明顯的差異(p0.05)。在目水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛和腹瀉犢牦牛的糞便均檢測(cè)到前庭目、三毛滴蟲目、桿線蟲目和Eugregarinorida(頂復(fù)亞門的一個(gè)目),而Neogregarinorida(頂復(fù)亞門的一個(gè)目)、毛滴目和Hypotrichomonadida(鞭毛蟲剛的一類寄生蟲),僅在腹瀉成年牦牛的糞便檢測(cè)到。腹瀉成年牦牛在毛滴目上,顯著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹瀉犢牦牛(p0.05),而健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛、腹瀉犢牦牛,在這其它目水平上均未發(fā)現(xiàn)顯著的差異(p0.05)。在科水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛和腹瀉犢牦牛的糞便均檢測(cè)到Simplicimonadidae(毛滴目下的一個(gè)科)和Haemonchidae(類毛樣線蟲上科)。而毛圓線蟲科僅在健康成年牦牛和腹瀉成年牦牛糞便檢測(cè)到。毛滴蟲科和網(wǎng)尾線蟲科僅在腹瀉成年牦牛糞便檢測(cè)到。Plectidae(色矛綱下的一個(gè)科)、圓線蟲科、Echinamoebidae(變形蟲門下的一個(gè)科)、衣孢蟲科、偽角毛蟲科和Panagrolaimidae(線蟲目下的一個(gè)科),僅在腹瀉成年牦牛糞便檢測(cè)到,且在毛滴蟲科上,腹瀉成年牦牛顯著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹瀉犢牦牛(p0.05)。在屬水平上,健康成年牦牛、腹瀉成年牦牛和腹瀉犢牦牛的糞便均檢測(cè)到內(nèi)變形蟲屬、布克斯頓纖毛蟲屬和血矛線蟲屬。而繞線屬和Echinamoeba(變形蟲門下的一個(gè)屬),僅在腹瀉成年牦牛的糞便中檢測(cè)到。毛圓線蟲屬和錐滴蟲屬,在健康成年牦牛和腹瀉成年牦牛的糞便均檢測(cè)到,但腹瀉犢牦牛的糞便未發(fā)現(xiàn)該蟲屬。簇蟲屬僅在腹瀉犢牦牛的糞便檢測(cè)出,健康成年牦牛和腹瀉成年牦牛的糞便均未發(fā)現(xiàn)該蟲屬。在四毛滴蟲屬上,腹瀉成年牦牛顯著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹瀉犢牦牛(p0.05)。4.急性腹瀉犢牦牛的寄生蟲病原調(diào)查本研究從我國(guó)四川某牦牛牧區(qū),采集了健康犢牦牛、急性腹瀉犢牦牛的新鮮糞便樣品。以糞便寄生蟲為研究對(duì)象、以18S SSU r DNA為切入點(diǎn)、以高通量測(cè)序?yàn)檩d體,全面分析了健康犢牦牛、急性腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便寄生蟲的多樣性與差異性,以發(fā)掘潛在的寄生蟲病原體。結(jié)果表明,在門水平上,健康犢牦牛、急性腹瀉便血死亡犢牦牛的糞便均檢測(cè)到頂復(fù)亞門、槽蟲門、苔蘚蟲門,且健康犢牦牛在槽蟲門上顯著高于腹瀉血便死亡犢牦牛(p0.0001),而在頂復(fù)亞門上,腹瀉血便死亡犢牦牛明顯高于健康犢牦牛(p0.0001)。副基體門僅在健康犢牦牛發(fā)現(xiàn),而Blastocysta、變形蟲門僅在腹瀉血便死亡犢牦牛檢出。在綱水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛均檢出Trichomonadea、Conoidasida、Phylactolaemata,而健康犢牦牛的Trichomonadea(p0.001)和Conoidasida(p0.0001)均顯著高于腹瀉血便死亡犢牦牛。Archamoebae、Aconoidasida、Blastocystidea這三綱僅在腹瀉血便死亡犢牦牛糞便檢出,而Hypotrichomonadea僅在健康犢牦牛檢出。在目水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便均檢測(cè)到Tritrichomonadida、Eugregarinorida和Plumatellida,且Tritrichomonadida、Eugregarinorida在統(tǒng)計(jì)學(xué)上,健康犢牦牛明顯高于腹瀉血便死亡犢牦牛(p0.0001)。Pelobiontida、Piroplasmida、Blastocystida、Adeleorina這四目?jī)H在腹瀉血便死亡犢牦牛糞便均檢測(cè)到,而Hypotrichomonadida僅在健康犢牦牛檢出。在科水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便均檢測(cè)到Simplicimonadidae、Gregarinidae和Plumatellidae這3科,且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上,健康犢牦牛的Simplicimonadidae(p0.0001)和Gregarinidae(p0.01)均顯著高于腹瀉血便死亡犢牦牛。Entamoebidae、Theileriidae、Trichomonadidae、Blastocystidae、Cryptosporidae這5科僅在腹瀉血便死亡犢牦牛檢測(cè)到,而Hypotrichomonadidae僅在健康犢牦牛檢出。在屬水平上,健康犢牦牛、腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便均檢測(cè)到Simplicimonas、Gregarina,且健康犢牦牛在這兩屬上均明顯高于腹瀉血便死亡犢牦牛,p值分0.0001和0.01。Entamoeba、Theileria、Tetratrichomonas、Blastocystis、Cryptosporidium這五種屬僅在腹瀉血便死亡犢牦牛的糞便檢出,而Hypotrichomonas僅在健康組犢牦牛的糞便檢測(cè)到。5.高原藏豬肺線蟲線粒體基因組分析本研究通過測(cè)序,將感染藏豬的肺線蟲鑒定為薩氏肺線蟲(Metastrongylus salmi),并首次揭示了藏豬M.salmi線粒體基因組信息。藏香豬M.salmi的線粒體基因組大小為13722 bp,堿基AT總含量為73.54%,核酸組成為A(23.52%)、C(6.14%)、G(19.60%)、T(50.02%)、N(UCAG)(0.73%)。包含12種蛋白編碼基因(cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad5、nad6、nad4L、atp6、cytb),22個(gè)t RNA和2個(gè)r RNA(rrn L、rrn S),而缺少編碼atp8蛋白的基因。藏香豬M.salmi線粒體基因組中的nad4L、atp6、nad2、cob、cox3、cox1、cox2、nad5基因的3‘端會(huì)緊挨著一個(gè)trn堿基序。藏香豬M.salmi線粒體基因組可翻譯氨基酸4237個(gè),其中以ATA為起始密碼子的最多41.7%(5/12);以TAA或TAG為終止密碼子的有11個(gè)(91.7%)。藏豬M.salmi線粒體基因使用的密碼子有63種,苯丙氨酸的密碼子UUU的使用頻率最高,而除密碼子CGC外,脯氨酸的密碼子CCC的使用次數(shù)最低。綜上所述本研究闡明了我國(guó)珍貴動(dòng)物(牦牛、藏豬)的七種寄生蟲血清流行病學(xué)特點(diǎn);初步探明了牦牛腹瀉的潛在寄生蟲病原;確定了5種寄生蟲的線粒體基因的分子特征;揭示了藏豬肺線蟲線粒體基因組信息、提供了分子標(biāo)記和潛在的藥物靶點(diǎn)信息。知己(不斷提高疾病的預(yù)防和治療水平等)和知彼(全面掌握寄生蟲的流行狀態(tài)、分子特征等),方能有效的解決我國(guó)高原牦牛、藏豬的寄生蟲疾病,為促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展助力,為減少人畜共患寄生蟲病對(duì)牧民的危害提供理論支持。
【圖文】：

圖 1-1 家養(yǎng)牦牛(A)、野牦牛(B)、藏豬(C)Fig 1-1 Domestic yaks, wild yaks, Tibetan pig1.2 牦牛和藏豬的分布牦牛主要分布在高寒、缺氧地帶（ 世界屋脊‖的青藏高原、天山及其周邊山脈）

（圖 1-3）（龔建軍等 2009, Li et al 2016, Li et al 2017）。不同地區(qū)的藏豬，有著不同的地區(qū)性名稱，如甘孜藏豬、西藏藏豬、迪慶藏豬等、蕨麻豬等等（周琳和王蜀金 2014）。由于藏豬有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，發(fā)展藏豬商品化產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖在我國(guó)多地區(qū)（包括兩江、兩湖、兩廣、重慶、山東等地）盛行起來，，且發(fā)展良好。關(guān)于藏香豬的具體數(shù)目，目前沒有確切的統(tǒng)計(jì)。我國(guó)西藏有藏種豬大概 3 萬頭、養(yǎng)殖藏豬 40 余萬頭；四川有香豬種豬約 2 萬頭（強(qiáng)巴央宗等 2001）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23;S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2589230