【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一種高度致死性急性傳染病,多種家畜和野生動物均易感,主要特征為發(fā)熱、奇癢(豬除外)及繁殖障礙。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動物疫病,我國也將其列為II類動物疫病。自從2011年以來,我國多個已經(jīng)免疫了PRV gE基因缺失疫苗豬場的豬群出現(xiàn)了類似PR的癥狀,給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失。2016年11月,吉林省長春市雙陽區(qū)某小型豬場,母豬出現(xiàn)流產(chǎn)和產(chǎn)死胎的現(xiàn)象,母豬無死亡病例。仔豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、體溫升高、精神不振、食欲減退以及輕微的神經(jīng)癥狀,新生仔豬發(fā)病率極高,死亡率達100%,該場從未接種過PRV疫苗。根據(jù)流行特點和臨床癥狀,初步判定為豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病和豬細小病毒病。為了驗證猜想,本研究通過流行病學調(diào)查、病理組織學觀察、PCR及RT-PCR技術、細菌學檢查、電鏡觀察、動物回歸實驗、間接免疫熒光試驗等方法從病理學和病原學兩個角度對該病進行了分析和研究。1、病理學診斷對送檢病豬進行常規(guī)病理剖檢,剖檢發(fā)現(xiàn),送檢病豬的各組織臟器均有不同程度的病理變化:心臟衰竭,左側心臟較右側更為明顯;肺臟充血水腫;腸系膜淋巴結腫大,小腸出現(xiàn)樹枝狀出血;肝臟和脾臟上均出現(xiàn)大量針尖狀灰白色壞死點和壞死灶,此病理變化為豬偽狂犬病的特征性病變。隨后制作石蠟切片,鏡檢發(fā)現(xiàn),肝臟、脾臟均發(fā)生局灶性壞死。肝臟壞死灶內(nèi)有炎性細胞的聚集,壞死灶周圍肝竇內(nèi)有紅細胞的淤積;脾臟壞死灶形態(tài)不規(guī)則,中心區(qū)域結構不清楚,鞘動脈周圍淋巴細胞壞死。這與豬偽狂犬病的特征性病理變化相吻合。2、病原學診斷研磨病料提取DNA,設計針對PRV的特異性引物進行PCR擴增,擴增出了與目的大小一致的片段。隨后設計針對豬細小病毒病和豬圓環(huán)病毒病的特異性引物進行鑒別診斷,PCR及RT-PCR的特異性擴增結果均為陰性,排除了豬細小病毒病和豬圓環(huán)病毒病的可能性。通過觸片染色方法進行細菌學檢查,排除了細菌感染的可能性。將感作好的加有雙抗的病料上清液接種BHK-21細胞進行病毒的分離,接種后72h并沒有出現(xiàn)細胞病變(cytopathic effect,CPE),隨后我們進行了盲傳,當盲傳至第8代時,細胞出現(xiàn)了變圓、折光率增強以及合胞體等典型的CPE現(xiàn)象。此時收集細胞病變液,進行電鏡觀察。利用Muench法測TCID_(50),得出該分離毒株的感染滴度為10~(-5.4)/0.1 mL。將細胞病變液反復凍融3次,離心取上清接種家兔,3d出現(xiàn)亢奮、奇癢以及輕度的神經(jīng)癥狀,皮膚抓咬破潰,6d內(nèi)全部死亡。對兔組織進行PCR鑒定,擴增了與出目的大小一致的條帶。剖檢可見腦膜充血,有大量的腦脊髓液;心臟充血,心包內(nèi)有大量積液;肺臟充血水腫。其他臟器并無明顯的病理變化。鏡檢,肺臟有炎性細胞浸潤,肺泡壁毛細血管充血;心肌變性,間質(zhì)增寬,有大量炎性細胞浸潤;脾臟淋巴濾泡體積縮小,紅髓間質(zhì)增寬,局部紅髓間質(zhì)內(nèi)可見較多的成纖維細胞。通過對PRV感染細胞和攻毒兔進行IFA鑒定發(fā)現(xiàn),接種病毒的BHK-21細胞胞漿及胞核內(nèi)和攻毒兔腦組織內(nèi)均有紅色熒光的出現(xiàn),這進一步證實了所分離毒株為豬偽狂犬病毒。分離出PRV后對分離株gE基因進行克隆測序,并進行變異性分析、同源性分析以及進化樹分析。通過變異性分析,確定該分離株為變異毒株;通過同源性分析,發(fā)現(xiàn)分離株與河南的變異株HeN1株gE基因核苷酸及編碼的氨基酸同源性最高,分別達99.9%和99.8%;通過進化樹分析得出,gE基因主要分為兩個大分支,本分離株與河南的變異株HeN1株親緣關系最近。本研究豐富了PRV變異株的遺傳進化規(guī)律,為研究和防控豬偽狂犬病打下了堅實的基礎。
【圖文】：

.2.3 病理組織學觀察鏡檢，肝臟局灶性壞死，壞死灶內(nèi)有炎性細胞聚集，壞死灶周圍肝竇內(nèi)有胞淤積（圖 2.2）。脾臟局灶性壞死，壞死灶形態(tài)不規(guī)則，，中心區(qū)域結構不清動脈周圍淋巴細胞壞死（圖 2.3）。圖 2.1 送檢豬主要眼觀病理特征（A）肝臟針尖狀灰白色壞死灶 （B）脾臟針尖狀灰白色壞死灶 （C）肺臟水腫 （D）腸系膜淋巴結腫大，小腸樹枝狀充血Fig 2.1 The main pathological characteristics in pigs(A) Liver needle-like gray necrosis (B) Spleen needle-like gray necrosis (C) Pulmonary edema(D) Mesenteric lymph nodes, small intestine dendritic hyperemia

2.2.4 病原學檢查2.2.4.1 細菌學檢查結果經(jīng)革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)，肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的觸片以及培養(yǎng)物中均未檢測出細菌。2.2.4.2 PCR 檢測結果利用上述設計的針對 PRV 的特異性引物進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像儀中觀察結果，可見擴增出與 PRV 預期大小一致的特異性條帶，長度為 494bp，如圖 2.4。圖 2.2 肝臟局灶性壞死(H&E, 400×) 圖 2.3 脾臟局灶性壞死(H&E, 100×)Fig. 2.2 Focal necrosis of the liver(H&E, 400×) Fig 2.3 Focal necrosis of the spleen(H&E, 100×)
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2588662