發(fā)布時間：2020-03-09 06:36

【摘要】：哺乳動物腫瘤抑制基因Discs large homologue1(Dlg1),是膜相關鳥苷酸激酶((m embrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的一員,通過PDZ區(qū)與其他分子相互作用參與微管極化,,心體再定向以及細胞遷移。Dlgl突變時,會出現(xiàn)微絲和微管的異常組裝而導致的細胞極性異常,如:柱狀上皮細胞去極化和細胞粘附分子的異常分布(呂鴻2010)。小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中Dlgl表現(xiàn)為極性分布,并且這種極性分布與細胞骨架微絲微管之間存在著密切關系。本研究以豬卵母細胞為材料,旨在觀察Dlg1在豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育進程中的表達定位,并在此基礎上通過RNA干擾技術,引入外源性si RNA,進一步研究Dlgl在這兩個發(fā)育過程中的作用。試驗結果如下:1、通過QRT-PCR檢測了豬多種組織細胞中Dlg1的mRNA表達水平。結果發(fā)現(xiàn)卵巢組織和肺組織中Dlg1的表達量最高,PEF中表達量最低。2、免疫熒光染色檢測豬卵母細胞和早期胚胎中Dlg1的蛋白表達和分布。發(fā)現(xiàn),在GV期豬卵母細胞中,Dlg1在整個胞質和細胞核均勻分布,從GVBD~PreMⅠ開始到MⅡ胞質中Dlg1逐漸向中心聚集,蛋白顆粒更明顯,皮質處的分布明顯減少;孤雌激活后的早期胚胎中,Dlg1在整個胞質彌散分布,但表達量逐漸下降2cell、4cell、囊胚期分別只有MⅡ期的46.9%、58.4%、29.66%。3、通過QRT-PCR和免疫熒光染色方法來篩選Dlg1的有效siRNA序列,結果顯示siRNA-2干擾效率最高,可分別在mRNA和蛋白水平上下調Dlg1表達的82.1%和61.28%。4、通過顯微注射的方法將Dlg1 siRNA-2注射到GV期的豬卵母細胞胞漿和孤雌激活后2h的胚胎中。結果顯示:siRNA-2注射組的第一極體排出率為25.2%±3.3%,與對照組(73.4%±4.7%)相比顯著下降,說明下調Dlg1能顯抑制豬卵母細胞體外成熟。而且,免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)下調Dlg1后影響體減數(shù)第一次分裂過程中微管裝配及紡錘體的形成;siRNA-2注射組的卵裂率和囊胚率分別為73.3%±0.7%和19.8%±1.8%,與對照組相比(76.9%±2.1%;22.9%±1.35)差異不顯著,說明下調Dlg1不影響豬早期胚胎的卵裂率和囊胚率。
【圖文】：

第一章 哺乳動物卵母細胞不對稱性的主要分子基礎哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂包含兩輪連續(xù)的不對稱分裂，形成一個大的全能的單體卵和兩個小的極體，，這種不對稱分裂是由后期開始之前卵母細胞內(nèi)不對稱分裂的發(fā)和發(fā)展決定的，包括不對稱的紡錘體定位、皮質分化這兩個關鍵的細胞內(nèi)事件。體外熟時，生發(fā)泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD）之后，減數(shù)第一次分裂的錘體在細胞中心形成，染色體排列之后染色體—紡錘體復合物立刻沿著紡錘體長軸朝皮質一側起始遷移。伴隨這個過程的是將在皮質定位的染色體誘導的一系列皮質重包括以肌球蛋白環(huán)圍繞富含肌動蛋白（Actin）的功能域為特點的 Actin cap 和皮質顆游離結構域的建立、膜微絨毛的消失以及相關分子的極性累積。紡錘體遷移、定位和質重組是卵母細胞不對稱分裂的基礎和關鍵。到了后期，富含 Actin 的功能域凸出，球蛋白環(huán)收縮導致含有一套同源染色體的第一極體（Polar Body 1，PB1）排出，PB出之后，卵母細胞進入第二次減數(shù)分裂并前進到中期（MⅡ），紡錘體在皮質下方第次分裂的區(qū)域重新裝配，皮質的肌動球蛋白域在紡錘體上方與 MⅠ相似的位置建立。在，卵母細胞完全成熟并阻滯在這個時期等待受精（圖 1-1）。

鼠卵母細胞兩階段染色體遷移和對稱性破壞(Yi et alchromosome migration and aymmertry breaking in m皮質極化發(fā)出皮質極性建立的信號（Cap）是對極體排出必需的結構。當減數(shù)第阻滯期間紡錘體不對稱地定位在皮質下方時 C86)。先前的研究表明，Cap 結構的建立依賴于染每一個染色體團分散，皮質同樣誘導形成 A有染色質）或者精子染色質注射進 MⅡ卵胞質003, Deng et al. 2007)，說明染色質誘導的皮質色體或者 DNA 刺激皮質結構域的形成與皮質是在一個 20-25um 的距離內(nèi)，并且誘導皮質結皮質極性的‘遠距離’效應與在 Ran 鳥苷三磷成的誘導類似，通過空間上分別行動的 Ran 鳥
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S828

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 王靜暉;許淑芳;王曉兵;劉適;王格;周瑞;夏冰;;DLG1基因多態(tài)性與炎癥性腸病遺傳易感性研究[J];河北醫(yī)學;2015年07期

相關博士學位論文 前2條

1 呂鴻;不對稱分裂相關分子在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中的作用研究[D];山東大學;2010年

2 王俊超;不對稱分裂分子在鼠卵母細胞減數(shù)分裂中的表達和功能研究[D];山東大學;2009年

相關碩士學位論文 前1條

1 陳瑞;CyclinA2在豬卵母細胞完成減數(shù)分裂中的作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

本文編號：2585750