【摘要】：為建立一種用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌的檢測(cè)方法,本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中公布的胞內(nèi)勞森菌16SrRNA設(shè)計(jì)引物建立PCR診斷方法。結(jié)果顯示:獲得了大小為481bp的PCR產(chǎn)物,核苷酸序列同源性分析結(jié)果均為99%以上;特異性試驗(yàn)表明該方法對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)菌、志賀菌、豬流行性腹瀉病毒和金黃色葡萄球菌均為擴(kuò)增陰性;敏感性試驗(yàn)表明該方法的最低檢出量為32.8μg/L;對(duì)20份臨床樣品陽(yáng)性檢出率為15%。結(jié)果表明:該方法具有較好的特異性和敏感性,適用于臨床檢測(cè)胞內(nèi)勞森菌。
【圖文】：

，驗(yàn)證該ＰＣＲ方法的特異性。１．７ＰＣＲ敏感性檢測(cè)提�。蹋杉�(xì)胞培養(yǎng)物的ＤＮＡ，并采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量。按照１０倍倍比稀釋法進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e取１μＬ各稀釋度ＤＮＡ模板進(jìn)行ＰＣＲ，以檢測(cè)該方法的敏感性。１．８應(yīng)用性檢測(cè)應(yīng)用建立的ＰＣＲ方法對(duì)２０份疑似患有豬增生性腸炎的病豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，，以證實(shí)該方法的臨床實(shí)用性。２結(jié)果２．１ＰＣＲ擴(kuò)增及序列測(cè)定ＰＣＲ擴(kuò)增獲得大約５００ｂｐ的特異性條帶，與目的條帶大小相近（圖１）。圖１ＬＩＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．ＬＩ陽(yáng)性樣品；２．陰性對(duì)照將目的條帶送往北京華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得大小為４８１ｂｐ的核苷酸序列。通過(guò)ＤＮＡＳＴＡＲ軟件分析所得序列與ＧｅｎＢａｎｋ上發(fā)表的其他胞內(nèi)勞森菌的１６ＳｒＲＮＡ序列的同源性，結(jié)果顯示該序列與ＧｅｎＢａｎｋ上發(fā)表的其他胞內(nèi)勞森菌的１６ＳｒＲＮＡ一致性均達(dá)到９９％以上（圖２），證明所得片段為胞內(nèi)勞森菌的１６ＳｒＲＮＡ序列。３７中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

圖２同源性比較２．２ＰＣＲ特異性檢測(cè)結(jié)果在最適的ＰＣＲ條件下，以ＬＩ陽(yáng)性樣品和其他對(duì)照樣品基因組ＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)，結(jié)果只有ＬＩ陽(yáng)性樣品擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果見(jiàn)圖３。圖３ＰＣＲ特異性試驗(yàn)Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＬＩ；２．大腸桿菌；３．沙門(mén)菌；４．志賀菌；５．豬流行性腹瀉病毒；６．金黃色葡萄球菌２．３ＰＣＲ敏感性檢測(cè)結(jié)果紫外分光光度計(jì)測(cè)得ＬＩ基因組ＤＮＡ的質(zhì)量濃度為３２８ｍｇ／Ｌ。稀釋質(zhì)量濃度為３．２８×１０－４～３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ。經(jīng)ＰＣＲ檢測(cè)，３．２８×１０－２～３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ質(zhì)量濃度的ＤＮＡ均有條帶，該ＰＣＲ方法能檢測(cè)到的最低胞內(nèi)勞森菌的含量為３２．８μｇ／Ｌ（圖４）。２．４應(yīng)用性檢測(cè)結(jié)果對(duì)疑似豬增生性腸炎的病料進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)，２０份病料中共檢測(cè)出３份陽(yáng)性ＰＣＲ產(chǎn)物，經(jīng)序列測(cè)定分析均為胞內(nèi)勞森菌，檢測(cè)率為１５％，表明該方法可用于臨床檢測(cè)豬增生性腸炎。３討論豬增生性腸炎是由胞內(nèi)勞森菌引起、在各種養(yǎng)殖條件下均可出現(xiàn)的全球性疾玻該病在很多國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，美國(guó)、澳大利亞、英國(guó)、瑞典、丹麥、韓國(guó)、法國(guó)和我國(guó)等地都有相關(guān)病例的報(bào)道［５］。經(jīng)圖４ＰＣＲ敏感性試驗(yàn)Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；２．３．２８×１０ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；３．３．２８ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；４．３．２８×１０－１ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；５．３．２８×１０－２ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；

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4 周勇岐;劉茂軍;蘇國(guó)東;朱曉瑋;丁美娟;邵國(guó)青;;副豬嗜血桿菌PCR鑒定方法的建立[J];豬業(yè)科學(xué);2007年12期

5 孫文東,向際堯,努爾波拉提,惠壽年,梁建莉;PCR及其應(yīng)用[J];新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1996年03期

6 周鋼,余細(xì)勇,林曙光;排除法PCR加變性梯度凝膠電泳鑒別未知基因[J];生物技術(shù);2002年01期

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9 劉敬忠;;首屆全國(guó)PCR學(xué)術(shù)研討會(huì)在京召開(kāi)[J];生命的化學(xué)(中國(guó)生物化學(xué)會(huì)通訊);1991年04期

10 梅玲玲,程蘇云,張嚴(yán)峻,朱敏;單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR鑒定技術(shù)的研究[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);2004年12期

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8 季芳;郝香芬;張艷春;李學(xué)家;張秀娟;夏機(jī)良;劉曉明;彭白露;;人和猴通用的糖尿病PCR芯片的制備及其應(yīng)用[A];第九屆中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)年會(huì)（2010新疆）論文集[C];2010年

9 徐福洲;楊兵;陳小玲;;PCR和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染雛雞雞傳染性貧血病毒的動(dòng)態(tài)分布[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2002年

10 眭元庚;張煒;徐正銓;;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在性病診斷中的應(yīng)用[A];江蘇省第二次性學(xué)研討會(huì)論文集[C];1998年

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3 李現(xiàn)明;無(wú)傳感器PCR芯片陣列的測(cè)量與控制技術(shù)研究[D];山東大學(xué);2007年

4 朱峰;應(yīng)用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)克隆凋亡相關(guān)基因[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1999年

5 趙湛;基于MEMS技術(shù)的PCR芯片的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（電子學(xué)研究所）;2003年

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6 鄧?guó)Q;3-PCR并聯(lián)機(jī)構(gòu)減振平臺(tái)的動(dòng)態(tài)性能分析[D];江南大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2580317