【摘要】：反芻動(dòng)物瘤胃能很高效的利用飼料中的粗飼料,并作為其主要的能量來源,主要因?yàn)榱鑫竷?nèi)有大量分解纖維素的纖維素分解菌。瘤胃纖維素菌大多數(shù)是嚴(yán)格厭氧菌,然而也存在兼性厭氧纖維素菌。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過體外培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),將從奶牛瘤胃內(nèi)分離的的兼性厭氧纖維素菌和固氮菌混合添加時(shí),能夠調(diào)節(jié)瘤胃的內(nèi)環(huán)境、并提高飼料的降解率。然而,兼性厭氧纖維菌是瘤胃內(nèi)固有的,還是從外界進(jìn)入的,目前還很少有人研究。由于瘤胃對(duì)于飼料是個(gè)“開放”的環(huán)境,一些兼性厭氧纖維菌和固氮菌可能隨飼料進(jìn)入瘤胃。我們推測在采食后一定時(shí)間內(nèi)的有氧環(huán)境中,兼性厭氧菌可能對(duì)發(fā)酵起到了一定作用。本試驗(yàn)選取一種從瘤胃液中分離的兼性厭氧固氮菌和從瘤胃液、土壤、飼料三種來源分離的兼性厭氧纖維素菌混合,探討其對(duì)體外發(fā)酵的影響。試驗(yàn)1:菌種的復(fù)活與計(jì)數(shù)試驗(yàn)選用的菌株由我所在實(shí)驗(yàn)室前期分離自飼料、瘤胃液、土壤,包括兼性厭氧纖維素菌和固氮菌。菌液與30%甘油以1:1比例混合保存在-20℃的冰箱中。每種來源選取高纖維素酶活性和低纖維素酶活性各一株,并使不同來源菌具有相近的纖維素酶活性。選定的纖維素菌株分別為:從土壤中分離的T1(2.576U·mL-1)和T4(0.351U·m L-1)、從飼料分離的S1(2.824U·mL-1)和S4(0.345U·m L-1)、以及從瘤胃液分離的L6(3.199U·m L-1)和L4(0.593U·m L-1)。另外,選取一株從瘤胃液分離的兼性厭氧固氮菌L5(17.637U·m L-1)。將所選取的菌株從冰箱中取出、解凍,然后進(jìn)行復(fù)活、增殖培養(yǎng)。試驗(yàn)2:混合菌對(duì)體外發(fā)酵的影響將試驗(yàn)1培養(yǎng)好的6個(gè)兼性厭氧纖維菌和兼性厭氧固氮菌混合(比例為4:1),形成6種混合菌,分別記為L4,S1,T4,L6,S4和T1,用其進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)在體外培養(yǎng)裝置上完成,裝置主要由HZS-H型恒溫水浴搖床和100 m L的注射器組成。本試驗(yàn)包括6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組7個(gè)重復(fù)(即7個(gè)注射器)。向每個(gè)注射器內(nèi)裝入0.200 g(精確到0.001 g)發(fā)酵底物(精:粗=45:55),加入1 m L的混合菌液(添加菌量均為1.2×109 CFU/m L,對(duì)照組內(nèi)加入1 ml滅活的混合菌液)和30 mL培養(yǎng)液,放入體外發(fā)酵培養(yǎng)裝置中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至2、4、8、12、24小時(shí),記錄注射器的讀數(shù)(即產(chǎn)氣量)。培養(yǎng)24 h發(fā)酵結(jié)束,將注射器內(nèi)全部培養(yǎng)物取出,并立即用酸度計(jì)測定pH,然后將培養(yǎng)物以3 500 r/min離心15 min,上清液分別裝入不同的離心管中,放置-20℃冰箱冷凍保存,待測氨態(tài)氮(NH_3-N)、菌體蛋白(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和濾紙酶活性、羧甲基纖維素鈉(CMC)酶活性、β-葡萄糖苷酶活性;另取上清液保存在-80℃冰箱,用于三種纖維素菌測定。沉淀用于測定干物質(zhì)降解率(DMD)。結(jié)果表明:加入混合菌的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比,加入混合菌的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比,各試驗(yàn)組產(chǎn)氣量顯著升高(P0.05);各試驗(yàn)組的DMD與對(duì)照組相比均有顯著提高(P0.05),其中T1試驗(yàn)組的DMD最高,而T4試驗(yàn)組的DMD最低;各試驗(yàn)組對(duì)pH的影響顯著提高(P0.05),其中L4試驗(yàn)組的pH最高,T1試驗(yàn)組的pH最低;各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比對(duì)NH_3-N的濃度的影響有顯著的提高(P0.05),其中T1試驗(yàn)組最高,L4、L6、T4試驗(yàn)組相對(duì)較高;各試驗(yàn)組的MCP濃度與對(duì)照組相比有顯著的提高(P0.05);各試驗(yàn)組對(duì)VFA濃度的影響有顯著提高(P0.05),且低于對(duì)照組,L4、試驗(yàn)組的VFA濃度最高,T1試驗(yàn)組的VFA濃度最低;各試驗(yàn)組對(duì)纖維素酶活的影響顯著均高于對(duì)照組,試驗(yàn)組中L4的濾紙酶活性最高,S1的濾紙酶酶活性最低、L4試驗(yàn)組的CMC酶活性最高,β-葡萄糖苷酶活基本相近;加入混合菌后試驗(yàn)組與對(duì)照組相比對(duì)白色瘤胃球菌的菌群數(shù)量的影響顯著變少(P0.05),然而對(duì)黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌卻有明顯的增加(P0.05)。低纖維素酶活與高纖維素相比對(duì)產(chǎn)氣量、pH、VFA、NH_3-N、均有顯著影響。然而對(duì)濾紙酶活性、CMC酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、DMD、及MCP等沒有顯著影響(P0.05)。綜上所述,添加的混合菌均促進(jìn)了體外發(fā)酵;分離自瘤胃液的低纖維酶活性兼性厭氧纖維菌(L4)與分離自瘤胃內(nèi)兼性厭氧固氮菌(L5)混合效果最好;低纖維素酶活性的兼性厭氧纖維菌的促進(jìn)發(fā)酵作用好于高纖維素酶活性兼性厭氧纖維菌。
【圖文】：

固氮菌的活化：同上。2.1.2 CFU 平板計(jì)數(shù)法將復(fù)活好的菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。CFU 即為菌落形成單位，，是平板計(jì)數(shù)法的常用單位。微生物平板計(jì)數(shù)方法簡介：對(duì)每個(gè)樣品使用 3 個(gè)稀釋度，且每個(gè)稀釋度做 3 個(gè)重復(fù)，關(guān)于 CFU統(tǒng)計(jì)值的準(zhǔn)確性，是與微生物檢測允許誤差、如何對(duì)平板菌落進(jìn)行正確計(jì)數(shù)以及 3 個(gè)稀釋度以哪一個(gè)稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)等問題密切相關(guān)的，然而這些問題飼料標(biāo)準(zhǔn)中并未有所規(guī)定。2.1.2.1 平板制作（1）將培養(yǎng)皿洗凈并干燥（注意此時(shí)要將各培養(yǎng)皿蓋方向一致），用報(bào)紙包好（注明皿蓋的方向），對(duì)其進(jìn)行高壓或干燥滅菌后備用。（2）先取剛滅菌后但尚未凝固的培養(yǎng)基置于無菌箱或超凈工作臺(tái)內(nèi)，稍微打開滅菌過的培養(yǎng)皿蓋（露一小縫），倒入培養(yǎng)基（無氮培養(yǎng)基羧和甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，厚度為 0.5 cm），封蓋后冷凝并倒置備用。然后按照平板計(jì)數(shù)法分別將 3 種來源纖維素分解菌和分離自瘤胃液中固氮菌的數(shù)量計(jì)出。圖 2-1 為 CFU 計(jì)數(shù)法具體示意圖（纖維素分解菌與固氮菌計(jì)數(shù)方法相同）。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S816.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2569671