【摘要】：為研究牛皰疹病毒Ⅰ型(BH V-1)對體外非免疫細(xì)胞——牛胚氣管細(xì)胞(EBTr)表達(dá)Toll樣受體2(TL R 2)的影響,了解TLR2在BHV-1感染時(shí)介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)機(jī)制,本試驗(yàn)將EBTr細(xì)胞分為BHV-1感染組和對照組,分別收集培養(yǎng)后第6、12、18、24及48小時(shí)的細(xì)胞總RN A和總蛋白,通過熒光定量PCR和W estern-blot技術(shù),檢測感染BHV-1后TLR2在基因和蛋白水平的動態(tài)變化。結(jié)果顯示,在第6和12小時(shí),感染組TLR2 m RNA和蛋白的相對表達(dá)量均低于對照組;在第48小時(shí),感染組TLR2 m RNA和蛋白的相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P0.01)。結(jié)果表明,BHV-1感染EBTr細(xì)胞會影響TLR2 m RNA和蛋白的表達(dá),提示TLR2參與宿主細(xì)胞對BHV-1的識別,觸發(fā)天然免疫,這為探索BHV-1感染的免疫機(jī)制提供了依據(jù)。
【圖文】：

2和β-actin的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同稀釋濃度的Ct值優(yōu)化最佳檢測范圍，構(gòu)建各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。TLR2和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線在1×102～1×109copies/L范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，分析獲得兩基因擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)R2均為1.000，擴(kuò)增效率E分別為95.81％和92.26％，標(biāo)準(zhǔn)曲線的各項(xiàng)指標(biāo)均符合定量PCR檢測要求（見圖1和圖2）。2.2BHV-1感染對EBTr細(xì)胞TLR2mRNA的影響用SYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法同時(shí)擴(kuò)增TLR2和β-actin基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和3個(gè)平行試驗(yàn)中制備的所有感染組、對照組EBTr細(xì)胞cDNA，圖1TLR2熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Thestandardcurveofreal-timePCRforTLR2TLR2copies/L循環(huán)數(shù)Cyclenumbers324

第3期周偉光等：牛皰疹病毒Ⅰ型感染對牛胚氣管細(xì)胞Toll樣受體2表達(dá)的影響0.00150.00100.00050.00006122448感染組lnfectiongroup對照組Controlgroup圖3BHV-1感染EBTr細(xì)胞后TLR2mRNA的表達(dá)變化Fig.3ThemRNAexpressionchangesofTLR2inEBTrcellsafterinfectionwithBHV-1**表示差異極顯著（P＜0.01）**Extremelysignificantdifference（P＜0.01）檢測TLR2和β-actin復(fù)制拷貝數(shù)。按Insun等［12］的方法，應(yīng)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出各檢測樣品TLR2mRNA的相對表達(dá)量，利用GraphPadPrism5.02軟件繪制BHV-1感染EBTr細(xì)胞后TLR2mRNA的動態(tài)變化柱狀圖（見圖3）。從圖3中可以看出，在第6和第12小時(shí)，攻毒組TLR2mRNA的相對表達(dá)量均低于對照組，且第6小時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；24～48h，攻毒組TLR2mRNA的相對表達(dá)量高于對照組，感染第48小時(shí)差異極顯著（P＜0.01）。2.3BHV-1感染對EBTr細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)的影響用Western-blot方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)感染組和對照組EBTr細(xì)胞TLR2和β-actin蛋白的表達(dá)量，結(jié)果（見圖4）顯示，在蛋白相對分子質(zhì)量為90及43ku處可見特異性陽性條帶，分別是TLR2及β-actin蛋白表達(dá)。計(jì)算兩組TLR2蛋白各不同時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量后繪制TLR2蛋白動態(tài)變化柱狀圖。結(jié)果（見圖5）顯示，第6和12小時(shí)，感染組TLR2蛋白的相對表達(dá)量均略低于對照組；24～48h，攻毒組TLR2蛋白的相對表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.01）。3討論BHV-1可引起牛的多系統(tǒng)感染，原發(fā)感染時(shí)，病毒從破損的皮膚和黏膜進(jìn)入機(jī)體，潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)，隨著宿主細(xì)胞DNA的復(fù)制而復(fù)制，，形成長期潛伏感染的狀態(tài)。當(dāng)宿主抵抗力下降時(shí)，潛伏的病毒被再次激活，導(dǎo)致明顯臨床疾病或亞臨床感染，所以機(jī)體需要依賴天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)來防

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