【摘要】：豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)與牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)同為黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的重要成員。CSFV的持續(xù)性感染是豬瘟難以根除的原因之一,對(duì)CSFV致病機(jī)理的闡明是制定有效防控措施的前提和基礎(chǔ)。病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖,除了自身編碼一些必需蛋白外,還需要宿主細(xì)胞多種成分的協(xié)助。分子伴侶(Molecular chaperone)是協(xié)助細(xì)胞在正常和脅迫條件下保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要蛋白組分,并參與許多細(xì)胞生理反應(yīng)過(guò)程。J-結(jié)構(gòu)蛋白(J-domain protein interacting with viral protein,Jiv)是屬于熱休克蛋白40家族(Heat-shock proteins 40,HSPs 40)的分子伴侶,在BVDV的感染和致病中發(fā)揮著重要作用。CSFV與BVDV的相關(guān)研究資料可相互借鑒。BVDV在自然界中有兩種不同的表現(xiàn)型,其中有宿主Jiv基因嵌合的毒株具有致細(xì)胞病變(CPE)的特性。這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在CSFV的研究當(dāng)中。BVDV的研究發(fā)現(xiàn)Jiv蛋白主要通過(guò)促進(jìn)NS2-3蛋白的切割進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制。本研究驗(yàn)證了Jiv蛋白核心區(qū)對(duì)CSFV復(fù)制的影響及其與病毒蛋白的相互作用,為篩選Jiv重組病毒的嵌合片段奠定基礎(chǔ)。此外,克隆獲得了CSFV C株全基因組c DNA,構(gòu)建了C株的感染性克隆并進(jìn)行了病毒的初步拯救。研究獲得以下結(jié)果:1.通過(guò)構(gòu)建Jiv蛋白核心區(qū)段的過(guò)表達(dá)和干擾質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)Jiv進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾,驗(yàn)證了Jiv蛋白在CSFV復(fù)制中的促進(jìn)作用。通過(guò)Co-IP的方法驗(yàn)證了Jiv蛋白與CSFV蛋白的相互作用。2.根據(jù)CSFV AF531433毒株的全基因組序列設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR及重疊延伸PCR的方法擴(kuò)增獲得覆蓋全基因組的8個(gè)片段。在基因組的5′端分別引入T7啟動(dòng)子序列及CMV啟動(dòng)子、核酶序列,在其3′端分別引入線(xiàn)性化酶切位點(diǎn)、T7終止子序列及SV40 Poly A終止序列。獲得兩種包含該病毒全長(zhǎng)c DNA克隆的感染性克隆p BR322-T7-CSFV及p BR322-CMV-CSFV。3.利用T7啟動(dòng)子,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA,檢測(cè)其濃度后通過(guò)電擊轉(zhuǎn)染到ST細(xì)胞當(dāng)中。利用CMV啟動(dòng)子將感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞進(jìn)行病毒粒子拯救。對(duì)細(xì)胞連續(xù)傳代后通過(guò)RT-PCR對(duì)病毒粒子核酸進(jìn)行檢測(cè)。
【圖文】：

了病毒粒子的拯救(Meyers et al. 1996)。Ruggli 等人用 CSFV CAP 株替換 Alfort 對(duì)應(yīng)段后構(gòu)建出嵌合的 Alfort 感染性克隆并拯救出了嵌合病毒(Ruggli et al. 1996)。Van Gennip 等人于 1999 年對(duì)病毒拯救的方法進(jìn)行了改進(jìn)(van Gennip et al. 1999)他們建立起一株穩(wěn)定表達(dá) T7 RNA 聚合酶的 SK6 細(xì)胞系，省去了體外轉(zhuǎn)錄的操作直對(duì)構(gòu)建好的 cDNA 克隆進(jìn)行病毒的拯救。這一改進(jìn)不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，而且大提高了效率。利用長(zhǎng)片段擴(kuò)增技術(shù)，，Rasmussen 等人于 2010年以病毒總 RNA為模通過(guò)一次性擴(kuò)增獲得了 CSFV Paderborn 株、C 株以及 BVDV CP7 毒株的全基因組列，并成功進(jìn)行了病毒的拯救，大大簡(jiǎn)化了感染性克隆的操作步驟(Rasmussen et 2010)。Li 等人在 2012 年利用真核細(xì)胞內(nèi)的 II 型 RNA 聚合酶系統(tǒng)再一次對(duì)感染性克的構(gòu)建進(jìn)行了改進(jìn)，使得操作更加簡(jiǎn)便、有效且構(gòu)建的反向遺傳系統(tǒng)更加穩(wěn)定(Li et 2013)。該系統(tǒng)構(gòu)建的感染性克隆在 CSFV 基因組的 5′添加了 CMV 啟動(dòng)子、內(nèi)含子列、T7 啟動(dòng)子以及榔狀核酶序列，保證了轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)效率以及重組質(zhì)粒在菌體中傳時(shí)的穩(wěn)定性。在 3′端加入了 HDV 核酶序列、T7 終止子序列以及 SV40PolyA 序列有效保證了 3′端轉(zhuǎn)錄的終止（如圖 2-2）。

3.3.3 過(guò)表達(dá)及干擾掉 Jiv 分子后對(duì) CSFV 增殖的影響將正常 PK15細(xì)胞與過(guò)表達(dá) Jiv分子及慢病毒 pCDH-U6- Jiv -sh2干擾 Jiv 的細(xì)時(shí)用 CSFV 進(jìn)行感染。48 h 后收取細(xì)胞核酸樣對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明 CSFV殖分別被促進(jìn)和抑制（圖 3-3）。說(shuō)明 Jiv 分子在豬瘟病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮了重用。圖 3-2 Real-time PCR及 Western blot檢測(cè)各質(zhì)粒的的干擾效果Fig. 3-2 The result of knock down of Jiv detected by Real-time PCR and Western blot
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 翁善鋼;;豬瘟的流行史和現(xiàn)狀[J];中國(guó)豬業(yè);2011年03期

本文編號(hào)：2567538