【摘要】：在2013年8月中旬,本實(shí)驗(yàn)室從山東省中東部地區(qū)45份有呼吸道癥狀水貂的肺組織中分離到兩株H9N2亞型的流感病毒,A/mink/Shangdong/F6/2013(H9N2)(Mk/SD/F6/13)株和A/mink/Shangdong/F10/2013(H9N2)(Mk/SD/F10/13)株,并且在265份血清樣本中,53份血清樣本中抗H9N2亞型流感病毒抗體為陽性,陽性率達(dá)到20%。根據(jù)Genbank中H9N2亞型流感病毒的各個基因序列,分別設(shè)計擴(kuò)各基因片段的特異性引物,采用RT-PCR方法擴(kuò)增Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS、M各段基因,并分別將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入T載體中進(jìn)行基因組測序并對序列進(jìn)行了分析。同源性分析結(jié)果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的八個基因片段的同源性為99.7%~100%;這兩株病毒的HA,NP和NS基因與A/chicken/Zhejiang/329/2011(H9N2)毒株的相應(yīng)片段同源性最高,分別為97.9%、98.7%、98.1%;NA和PB1基因與A/duck/Hunan/S4111/2011(H9N2)毒株的相應(yīng)片段同源性最高,分別為98.2%、98.6%;PA和M基因與A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株的相應(yīng)片段同源性最高,分別為98.6%、99.4%;然而,PB2基因與A/Turkey/California/189/66(H9N2)毒株的PB2基因同源性最高,為97.2%。為了進(jìn)一步分析兩株H9N2亞型流感病毒的基因片段的起源,用GeneBank中的H9N2亞型流感病毒的序列作為參考序列,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。HA基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13位于歐亞系的Y280亞系分支上,并且與A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株具有最近的親緣關(guān)系;在NA的進(jìn)化樹上,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13均位于歐亞系的Y280亞系分支上并且與A/duck/Hunan/S4111/2011(H9N2)具有最近的親緣關(guān)系;“內(nèi)部基因”PB1,PA,NP,M和NS的基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13均位于歐亞系的Shanghai/F/98亞系分支上且與A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株具有最近的親緣關(guān)系;PB2基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13位于北美系的A/Turkey/Wisconsin/1/66的分支上。為進(jìn)一步揭示Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的分子特征,用DNASTAR軟件分別推導(dǎo)Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13各基因片段的氨基酸序列,并與參考毒株進(jìn)行比較分析。氨基酸序列分析結(jié)果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的氨基酸序列同源性為100%;Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13 HA蛋白的第226位氨基酸均為亮氨酸(Leu),具有SAα-2,6-Gal的受體結(jié)合特性;在HA蛋白的裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為RSSR,表明兩株病毒均是低致病性的毒株;HA蛋白有8個潛在糖基化位點(diǎn),與A/Chicken/Shanghai/F/98和A/Chicken/Beijing/1/94兩參考株相比,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13在218位氨基酸處丟失了一個潛在的糖基化位點(diǎn),在313位氨基酸處增加了一個潛在的糖基化位點(diǎn);Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的PB2蛋白的627位氨基酸位點(diǎn)為Lys,說明該兩毒株具有哺乳動物受體結(jié)合特性。為了解所分離毒株對水貂的致病性,用Mk/SD/F6/13毒株作為代表毒株,建立了H9N2亞型流感病毒對水貂致病性研究的實(shí)驗(yàn)動物模型,并對臨床癥狀、剖檢病理變化、排毒情況、組織病理學(xué)變化、病毒在組織器官的分布、血清抗體等各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測。在試驗(yàn)期間,感染水貂表現(xiàn)出輕微呼吸道癥狀;在1~4天的鼻咽拭子檢測到H9N2亞型流感病毒;感染水貂肺臟組織表現(xiàn)出血性間質(zhì)性肺炎、心臟組織表現(xiàn)心肌纖維間出血、脾臟組織出血組織病理學(xué)變化;從感染水貂的肺臟、心臟、氣管、結(jié)腸中檢測到H9N2亞型流感病毒;在感染水貂的血清中檢測到抗H9N2亞型流感病毒抗體,效價為1:64-1:512;實(shí)驗(yàn)期間感染水貂沒有出現(xiàn)死亡。結(jié)果表明Mk/SD/F6/13毒株確實(shí)能夠感染水貂并且致病性較低。本研究第一次證實(shí)了水貂能夠自然感染H9N2亞型流感病毒,這不僅可能會對水貂的養(yǎng)殖業(yè)造成危害,而且水貂也可能成為流感病毒的中間宿主而感染其他動物。盡管貂源H9N2亞型流感病毒對其他動物的感染能力尚不清楚,但本研究對做好H9N2亞型流感病毒的防制和監(jiān)測工作提供了重要的分子流行病學(xué)資料,因而具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.92

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2559991