【摘要】：鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)引起的雛鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)呈世界性分布,雛鴨發(fā)病死亡后呈現(xiàn)明顯的角弓反張癥狀,病理上以肝臟腫大出血為主要特征,具有高度傳染性和接觸性。該病發(fā)病迅速,致死率高。DHAV可分為三個基因型:DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。在我國大陸,鴨病毒性肝炎主要由DHAV-1和DHAV-3引起,兩種病毒感染雛鴨后的臨床癥狀和病理變化極為相似,臨床診斷難以對其進(jìn)行區(qū)分,且生產(chǎn)中存在二者混合感染現(xiàn)象,這為該病的防治增添了困難。本研究建立了可以同時檢測DHAV-1與DHAV-3的雙重?zé)晒舛縋CR方法,并對DHAV-1和DHAV-3在山東省內(nèi)的流行病學(xué)及臨床上病毒在雛鴨體內(nèi)的分布進(jìn)行了研究。本研究主要包括兩部分:1.檢測DHAV-1與DHAV-3的雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立根據(jù)DHAV-1和DHAV-3基因組序列比對結(jié)果,分別于兩種病毒序列保守區(qū)設(shè)計合成了兩對能特異性擴(kuò)增片段的引物和兩條TaqManTM探針,探針分別以CY5/BHQ-2和FAM/TAMRA雙標(biāo)記,建立了能夠同時檢測DHAV-1和DHAV-3的雙重?zé)晒舛縋CR診斷方法。經(jīng)條件優(yōu)化后,檢測DHAV-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為YDHAV-1=-3.2850x+40.812,相關(guān)系數(shù)為0.998,PCR循環(huán)效率為101.5%,在6.7×103~6.7×107copies/μL內(nèi)有良好的線性關(guān)系,檢測DHAV-1病毒cDNA模板的靈敏度為14copies/PCR,組內(nèi)變異系數(shù)為0.28%~1.24%,組間變異系數(shù)為0.29%~0.79%;檢測DHAV-3方法中標(biāo)準(zhǔn)曲線為YDHAV-3=-3.2791x+39.216,相關(guān)系數(shù)為0.999,PCR循環(huán)效率為101.8%,在1.1×102~1.1×107copies/μL內(nèi)有良好的線性關(guān)系,檢測DHAV-3病毒cDNA模板的靈敏度為22copies/PCR,與單重?zé)晒舛縋CR一致,組內(nèi)變異系數(shù)為0.28%~1.81%,組間變異系數(shù)為0.22%~0.72%;特異性試驗結(jié)果顯示,同一體系內(nèi)兩對特異性引物和探針只能從對應(yīng)的陽性樣本中擴(kuò)增出特異片段,DHAV-1和DHAV-3相互之間無交叉擴(kuò)增反應(yīng),對其他七種禽類常見病原及健康鴨肝組織也無擴(kuò)增,表明其特異性良好。分別應(yīng)用所建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法和常規(guī)RT-PCR方法對30份人工感染DHAV-1和DHAV-3雛鴨肝臟以及200份臨床疑似患DVH病鴨的肝臟進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:兩種方法對人工感染DHAV-1和DHAV-3雛鴨的檢測陽性率均為100%。用熒光定量PCR方法對200份疑似患鴨病毒性肝炎病鴨的肝臟的臨床樣本進(jìn)行檢測,DHAVs的檢出率為97.5%,DHAV-1的陽性檢出率為29%,DHAV-3的陽性檢測率為56.5%,混合感染陽性率為12%。送檢雛鴨共31群,4群檢出混合感染,13群DHAV-1陽性感染,13群DHAV-3陽性感染。研究結(jié)果表明建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法具有良好的特異性和敏感性,可用于快速鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3以及對感染雛鴨體內(nèi)病毒的實(shí)時定量檢測。2.DHAV-1和DHAV-3在臨床中雛鴨體內(nèi)的分布規(guī)律研究對臨床送檢的DHAV陽性病死雛鴨進(jìn)行各臟器的采集,包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、法氏囊、腦和胰腺,應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縋CR法定量檢測DHAV-1和DHAV-3在雛鴨體內(nèi)病毒分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):被檢組織器官中均可檢測到DHAV,但不同組織中DHAV含量差異較大,表明DHAV在雛鴨體內(nèi)有廣泛的組織嗜性。剖檢可見雛鴨的肝臟、脾臟和腎臟眼觀病變最為明顯,大多呈現(xiàn)腫大和出血、壞死,熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,DHAV-1和DHAV-3含量最高的器官依次為肝臟和脾臟,其中DHAV-1病毒含量依次高達(dá)1012.32和1011.23copies/g,DHAV-3病毒含量依次高達(dá)1012.07、和1011.63copies/g。剖檢胸腺、胰臟有出血現(xiàn)象,法氏囊腫大,部分腦組織出現(xiàn)水腫和液化灶。胸腺、胰臟、心臟、腦和法氏囊也可檢測到DHAV,但含量略低,以上結(jié)果顯示雛鴨體內(nèi)臟器病理變化的嚴(yán)重程度與病毒含量呈正相關(guān)關(guān)系,且肝臟和脾臟是DHAV增殖的理想靶器官。通過獨(dú)立樣本T檢驗分析,結(jié)果顯示,雛鴨混合感染DHAVs死亡后與單獨(dú)感染后同一器官中的病毒含量沒有明顯差異,表明混合感染對病毒在雛鴨體內(nèi)的后期增殖沒有影響。送檢雛鴨的死亡日齡集中在5~14日齡,且經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,雛鴨體內(nèi)的病毒含量與雛鴨日齡沒有相關(guān)性,該結(jié)果為鴨病毒性肝炎的致病機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.32

【參考文獻(xiàn)】

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1 謝麗基;謝芝勛;龐耀珊;謝志勤;劉加波;鄧顯文;范晴;;鴨Ⅰ型肝炎病毒熒光定量RT-PCR方法建立及初步應(yīng)用[J];中國家禽;2012年10期

2 張小飛;吳亦倫;趙瑞宏;潘孝成;盛曉蓉;陳鑫;;免疫酶組化法對試驗感染雛鴨體內(nèi)鴨肝炎病毒的分布測定[J];中國獸醫(yī)雜志;2005年12期

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1 劉建;鴨肝炎病毒的分離與檢測[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

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本文編號：2551673