【摘要】：為了研究瘦素對ATDC5細胞增殖分化的影響,本試驗以ATDC5細胞作為軟骨細胞模型,分別采用0 ng/m L(對照組)、10 ng/m L、100 ng/mL三種不同濃度的瘦素刺激ATDC5細胞。在ATDC5細胞培養(yǎng)14 d時,進行阿利新藍蛋白聚糖染色,采用RT-PCR法檢測Ⅱ型膠原、Sox9、Aggrecan基因的相對表達量,用Western blot法檢測Sox9及Aggrecan的蛋白相對表達量;21 d時,進行茜紅S鈣化結(jié)節(jié)染色,采用RT-PCR法檢測Ⅹ型膠原mRNA的表達量,Western blot法檢測Ⅹ型膠原蛋白的相對表達量,在此之后檢測瘦素對堿性磷酸酶活性的影響。本試驗結(jié)果顯示:阿利新藍染色后,各組之間并無肉眼可見的差異,不足以證明瘦素對蛋白聚糖分泌量的影響;茜紅鈣化結(jié)節(jié)染色后,通過檢查結(jié)節(jié)數(shù)量的多少發(fā)現(xiàn),隨著瘦素濃度增加鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量減少。通過基因與蛋白水平的進一步檢測發(fā)現(xiàn),Sox9 m RNA表達量隨著瘦素濃度的增加呈下降趨勢,實驗組與對照組之間相比差異極顯著(P0.01),兩實驗組間相比差異極顯著(P0.01);其蛋白的相對表達量在瘦素濃度為10 ng/m L和100 ng/m L時均呈上升趨勢,與對照組相比差異極顯著(P0.01);隨著瘦素濃度增高,Ⅱ型膠原mRNA表達量在瘦素濃度為10 ng/m L時有所增加,與對照組相比差異顯著(P0.05),瘦素濃度為100ng/m L時表達量下降。與對照組無差異(P0.05),與10 ng/m L組相比差異顯著(P0.05);與對照組相比,隨瘦素濃度增加,Aggrecan m RNA表達量呈下降趨勢,瘦素濃度為10 ng/m L時,基因表達量與對照組相比差異顯著(P0.05),瘦素濃度為100 ng/m L時,mRNA的表達量與對照組相比,差異極顯著(P0.01),兩個加瘦素的實驗組相比,差異極顯著(P0.01),其蛋白表達量與基因的表達趨勢一致,也隨瘦素濃度的增加而下降,100 ng/m L組與對照組相比差異顯著(P0.05),其它均無差異(P0.05),以上結(jié)果表明,瘦素濃度的增加會抑制Sox9基因的表達,但其蛋白的表達量反而增加。在一定范圍內(nèi),瘦素濃度的增加會促進Ⅱ型膠原,但瘦素濃度超過一定范圍,Ⅱ型膠原的分泌量便會下降;較高濃度的瘦素會抑制Aggrecan基因以及蛋白的表達;Sox9可以增強Ⅱ型膠原與Aggrecan啟動子的活性,而瘦素下調(diào)了Sox9的基因表達量,因此Ⅱ型膠原與Aggrecan的表達量下降。與對照組相比,Ⅹ型膠原mRNA表達量隨著瘦素濃度的增加顯著上升,瘦素濃度為10 ng/m L時,與對照組之間無差異(P0.05),瘦素濃度為100 ng/m L時,其mRNA的相對表達量明顯增加,與對照相比差異極顯著(P0.01),與10 ng/m L組相比差異極顯著(P0.01);Ⅹ型膠原蛋白的表達量在瘦素濃度為10 ng/m L和100 ng/m L時均顯著上升,且兩實驗組組之間差異極顯著(P0.01),且兩實驗組與對照組相比差異極顯著(P0.01);堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果表現(xiàn)為:ALP活性隨著瘦素濃度的增加而增強。軟骨細胞分化后期會發(fā)生肥大,分泌Ⅹ型膠原,瘦素濃度增加會促進Ⅹ型膠原的分泌,抑制鈣化,堿性磷酸酶活性增強。Ⅱ型膠原、Sox9、Aggrecan、Ⅹ型膠原以及堿性磷酸酶是細胞增殖分化的不同階段所分泌的不同標志性因子,存在于細胞外基質(zhì)中,這些因子的變化會反映出整個骨關節(jié)的狀態(tài)。本試驗的檢測結(jié)果表明,一定濃度的瘦素會抑制ATDC5細胞的增殖分化。正常的軟骨組織組織中瘦素含量很低,本實驗供給的外源性瘦素,相當于較高濃度的瘦素水平。因此,本試驗認為瘦素濃度的增加會在一定程度上抑制ATDC5細胞的增殖分化,且濃度越高作用越強,瘦素水平較高,細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞,細胞長期處于肥大階段,鈣化作用受阻,導致骨形成障礙。
【圖文】：

P<0.05，**表示差異極5，##表示 100 ng/mL 與 10 ta compared with control ly significant, P<0.01; # repextremely significant differenc圖 3-1 CCK8 細胞活性3-1 Detection of CCK8 ce測結(jié)果 RNA測定發(fā)現(xiàn)，OD260取的樣品總 RNA 濃度可發(fā)現(xiàn)，，清晰可見 28 S、1解。

圖 3-3 阿利新藍染色結(jié)果Fig.3-3 The results of Alcian blue staining如圖 3-4 所示，隨著瘦素濃度的增加，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量減少，說明隨著瘦素濃度的增加，鈣化作用減弱。圖 3-4 茜紅染色結(jié)果Fig.3-4 The results of alizarin red staining3.4 瘦素對 ALP 活性的影響如表 3-5 所示，加入瘦素后，與對照組相比較，在瘦素濃度為 10 ng/mL 時，堿性磷酸活性上升，差異顯著（P<0.05）；瘦素濃度為 100 ng/mL 時，與對照組相比差異極顯著（P<0.01
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.2

【參考文獻】

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本文編號：2550298