【摘要】：傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)所引起的一種雞的急性、高度接觸性呼吸道傳染病,給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。目前,國內(nèi)外預(yù)防本病主要依靠弱毒疫苗,但弱毒疫苗的毒力偏強,接種后往往出現(xiàn)不良反應(yīng)；另外,由于ILTV可以潛伏感染,弱毒疫苗在雞群傳播過程中會發(fā)生毒力返強。對國內(nèi)部分地區(qū)ILT的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),ILT的暴發(fā)可能與弱毒疫苗有關(guān)。因此,研制安全有效的基因工程疫苗已成為人們的共識。本研究以ILTV Anhui-2011株為模板擴增gB、gD基因,然后分別將其克隆至含有火雞皰疹病毒(HVT) FC-126疫苗毒株基因組US2序列的轉(zhuǎn)移載體(pUp-Down)中,構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUp-gB-Down、pUp-gD-Down。隨后將含有LTR啟動子和EGFP報告基因的表達盒分別克隆至上述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中,構(gòu)建HWT轉(zhuǎn)移載體pHVT-gB、pHVT-gD。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)移載體與HVT基因組共轉(zhuǎn)染CEF次代細胞,獲得帶有綠色熒光標記的重組病毒。提取重組病毒基因組,用Cre重組酶敲除EGFP報告基因,通過再次轉(zhuǎn)染CEF次代細胞,獲得僅帶有LTR啟動子和目的基因的重組病毒rHVT-gB、rHVT-gD。通過PCR和Western-Blot試驗對重組病毒進行鑒定,結(jié)果表明目的基因gB、gD成功插入HVT基因組中,并能正確表達gB、gD蛋白。重組病毒對ILT的免疫保護試驗：將90只1日齡SPF雞隨機分為5組,第1、2組為重組病毒免疫組,第3組為攻毒對照組,第4組為弱毒活疫苗對照組,第5組為空白對照組。弱毒疫苗免疫3周后,除空白對照組,各試驗組均氣管內(nèi)接種105EID50ILTV強毒,繼續(xù)觀察10天。統(tǒng)計分析各組臨床癥狀、攻毒前后雞體增重、發(fā)病率死亡率、抗體消長及病理組織學(xué)變化。結(jié)果顯示：攻毒后第二天即有雞發(fā)病,臨床癥狀高峰期出現(xiàn)于攻毒后第四天。重組病毒rHVT-gB的發(fā)病率為20%,死亡率為5%,免疫保護高于弱毒苗組,差異顯著(p0.05)；重組病毒rHVT-gD的發(fā)病率為30%,死亡率為15%,免疫保護高于弱毒苗組,但差異不顯著(p0.05)。結(jié)果表明,1日齡SPF雞接種重組病毒后能建立起針對ILT強毒株的有效保護,且rHVT-gB明顯比rHVT-gD組免疫保護效果好。重組病毒對MD的免疫保護試驗：將60只1日齡SPF雞隨機分為4組,第1、2組分別為重組病毒免疫組,第3組為FC-126疫苗組,第4組為攻毒對照組。免疫1周后,各試驗組均腹腔接種5000 PFU MDV超強毒株RB1B。攻毒后每天觀察雞群至90日齡。結(jié)果顯示,重組病毒與親本毒株FC-126均可對MD超強毒株的攻擊產(chǎn)生有效免疫保護,說明外源基因的插入并不影響親本毒株的免疫保護效力。
【圖文】：

圖１－１邋ＩＬＴＶ結(jié)構(gòu)示意圖逡逑

圖１－２邋ＩＬＴＶ電鏡照片逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｉｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋ＩＬＴＶ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2546061