【摘要】：鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬成員,該病毒主要侵害3周齡內(nèi)的雛鵝和雛番鴨,故引起的疾病被稱為小鵝瘟。該病最早見于我國學(xué)者方定一的報道,具有傳播快、死亡率高的特點。3-20日齡的雛鵝和雛番鴨易感性高,死亡率可達(dá)90%-100%。發(fā)病日齡越小死亡率越高。鵝細(xì)小病毒基因全長約5kb,基因組包括左右2個開放閱讀框,其中左側(cè)開放閱讀框編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,包括NS1和NS2。其中,NS1基因由1 884個核苷酸組成。NS1在病毒的致病性、復(fù)制及調(diào)節(jié)表達(dá)方面發(fā)揮了重要的作用。NS1為磷酸化蛋白,同參與調(diào)節(jié)啟動子的細(xì)胞因子結(jié)合,在鵝細(xì)小病毒DNA早期復(fù)制過程有多種功能;NS1可與病毒DNA復(fù)制起始序列高親力結(jié)合,對病毒DNA的復(fù)制是必須的;NS1可抑制細(xì)胞DNA的復(fù)制且對衣殼蛋白的啟動子起正調(diào)節(jié)作用,除此之外NS1可對P41啟動子起負(fù)調(diào)節(jié)作用。目前國內(nèi)外研究的熱點主要集中在GPV結(jié)構(gòu)蛋白,對于非結(jié)構(gòu)蛋白的研究較少。本實驗構(gòu)建了NS1表達(dá)載體,開展了NS1蛋白與鵝胚成纖維細(xì)胞蛋白互作研究,旨在為闡明GPV病毒復(fù)制的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。本研究共分為以下四個部分:1、鵝細(xì)小病毒梨樹分離株的分離鑒定及其NS1基因序列測定與分析:采用鵝胚從吉林省梨樹縣疑似小鵝瘟死亡雛鵝的臨床病料中分離到1株病毒,經(jīng)電鏡負(fù)染觀察和GPV特異性PCR引物鑒定,證明所分離病毒為鵝細(xì)小病毒,命名為GPV/2010/LS株。擴增并克隆了GPV/2010/LS株非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因。序列分析表明,該毒株NS1基因及其氨基酸序列與臺灣分離株82-0321、上海分離株SHFX1201、揚州地區(qū)分離株YZ99-6和長春分離株CH同源性很高,且NS1基因相對比較保守。2、鵝胚成纖維細(xì)胞與GPV NS1蛋白互作蛋白的篩選及鑒定:利用Clontech公司的SMART技術(shù),快速、高效的構(gòu)建了鵝胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫。采用酵母雙雜交技術(shù),以非結(jié)構(gòu)基因NS1為誘餌蛋白,成功構(gòu)建重組載體pGBKT7-NS1,用該誘餌載體篩選構(gòu)建了鵝胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫。利用多重篩選培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA、SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA篩選出陽性酵母雙倍體,拯救酵母雙倍體文庫質(zhì)粒,送生物公司測序,并對測序結(jié)果比對分析。結(jié)果顯示,構(gòu)建了濃度為4×106 pfu/mL的鵝胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫。構(gòu)建了重組載體pGBKT7-NS1,并表達(dá)和驗證。從鵝胚成纖維細(xì)胞酵母雙雜交文庫中篩選出兩種與鵝細(xì)小病毒NS1互作蛋白并測序,在線Blast鑒定為由411個堿基對編碼的核糖體S12蛋白(命名GEF/2011/GP1)和由296個堿基對編碼的未知蛋白(命名GEF/2011/GP2)。3、鵝胚成纖維細(xì)胞GP1和GP2與小鵝瘟病毒NS1相互作用的GST-pulldown驗證:構(gòu)建了pGEX-4T-1-NS1原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)出95 kDa大小的NS1蛋白。構(gòu)建了pcDNA-3.0-Flag-GP1和pcDNA-3.0-Flag-GP2兩個真核表達(dá)質(zhì)粒,并成功獲得表達(dá)。利用GST-pulldown技術(shù)驗證,GPV NS1蛋白能與鵝胚成纖維細(xì)胞GP1和GP2蛋白相互作用。為后期研究GP1和GP2在鵝胚成纖維細(xì)胞內(nèi)外對GPV增殖的影響奠定了基礎(chǔ)。4、與GPV NS1互作的鵝胚成纖維細(xì)胞蛋白對GPV增殖的影響:本實驗已經(jīng)通過GST-pulldown技術(shù)確定GPV與鵝胚成纖維細(xì)胞互作的GP1和GP2蛋白,為了進(jìn)一步研究這兩種蛋白對GPV的復(fù)制影響,我們進(jìn)行了兩方面研究。一是在GEF細(xì)胞外,LS株GPV與純化后的GP1和GP2蛋白相互作用再感染GEF細(xì)胞,采用SYBR Green I法熒光定量檢測手段檢測GPV的增殖情況,判斷該兩種蛋白對GPV增殖的影響;二是在GEF細(xì)胞內(nèi),將含有GP1和GP2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GEF細(xì)胞,同時感染LS株GPV,采用SYBR Green I法熒光定量檢測GPV的增殖情況,判斷GP1和GP2蛋白在細(xì)胞內(nèi)對GPV復(fù)制的影響。測定了LS株GPV的TICD50,將病毒和GEF細(xì)胞比例MOI值確定為1。利用GST-pulldown技術(shù)將GST-GP1和GST-GP2蛋白分別純化,測出GP1和GP2蛋白濃度分別為0.54μg/μL和0.38μg/μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在GEF細(xì)胞外,隨著GP1和GP2蛋白含量的增加,GPV增殖的核酸拷貝數(shù)值逐漸變小,說明兩種互作蛋白對GPV的增殖有抑制作用。在GEF細(xì)胞內(nèi),12 h后檢測轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組GPV核酸拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn)其無明顯變化;轉(zhuǎn)染和接毒24 h后檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組GPV核酸拷貝數(shù)值出現(xiàn)明顯變化,即轉(zhuǎn)染含有GP1真核表達(dá)質(zhì)粒的實驗組GPV的核酸拷貝含量是對照組(單獨GPV感染GEF細(xì)胞)含量的2.6倍,轉(zhuǎn)染含有GP2真核表達(dá)載體的實驗組GPV的核酸拷貝含量是對照組(單獨GPV感染GEF細(xì)胞)含量的0.3倍。同時,采用以Flag單克隆抗體為二抗的Western blot試驗,證明轉(zhuǎn)染兩種真核表達(dá)質(zhì)粒的GEF細(xì)胞表達(dá)了外源蛋白。分別單獨和混合轉(zhuǎn)染含有GP1和GP2真核表達(dá)質(zhì)粒,同時接種GPV,24 h后檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染含有GP1真核表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞組,GPV核酸拷貝數(shù)是對照組(含病毒和水)的1.89倍,是混合轉(zhuǎn)染組的2.56倍,是GP2組的7.77倍。再次證明,在GEF細(xì)胞內(nèi),GP1蛋白對GPV增殖具有促進(jìn)作用,GP2蛋白則相反具有抑制作用。從臨床病料分離到1株病毒,命名為GPV/2010/LS株,擴增克隆NS1基因,序列分析表明NS1基因相對保守。NS1為非結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒的生活周期中起著十分重要作用。本實驗構(gòu)建了NS1表達(dá)載體,研究NS1蛋白與宿主纖維細(xì)胞蛋白互作,具有一定的意義。構(gòu)建了鵝胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫,利用酵母雙雜交技術(shù),以非結(jié)構(gòu)基因NS1為誘餌蛋白,從文庫中篩選出與NS1互作蛋白核糖體S12蛋白(命名GP1)和由296個堿基對編碼的未知蛋白(命名GP2)。研究S12蛋白對GPV復(fù)制的影響,對了解GPV的感染機制、致病機理等方面方面均有重要意義,為該病的防治能提供一定參考依據(jù)。
【圖文】：

空離心 1 min 后，室溫開蓋靜置的離心管中，加入 25 μL Elutionn 離心 1 min；緩沖液再次加入吸附柱中（增加%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 PCR 鑒定，PCR 體系見表 1-1，腸內(nèi)容物與滅菌生理鹽水混合研可見血管明顯充血，全身出血變分離病毒命名為 GPV/2010/LS 株

GPV病毒粒子電鏡圖
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2541808