【摘要】：已有研究證實,綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和成肌細(xì)胞等分化的潛能。為了建立誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的方法,本研究在構(gòu)建小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)染至綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)。對誘導(dǎo)細(xì)胞進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)以及基因表達(dá)等檢測,以期最終獲得綿羊成肌細(xì)胞。本研究中獲得結(jié)果如下：1.小鼠MyoD基因的克隆參照GenBank中的小鼠MyoD基因序列(NM_010866),采用RT-PCR擴增技術(shù),克隆小鼠Myo D基因,將其連接到pcDNA3.1 (+)載體,獲得MyoD-pcDNA3.1真核表達(dá)載體：將獲得的MyoD-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中,采用Real-Time PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞分析等進行活性檢測。其結(jié)果,MyoD-pcDNA3.1在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中具有表達(dá)活性；2.MyoD-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞將冷凍保存的綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80%匯合時,分別進行下列處理：1)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并在培養(yǎng)基中添加DMSO作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)(A組)；2)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,轉(zhuǎn)染MyoD-pcDNA3.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒(B組)；3)用添加有DMSO誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(C組)。在經(jīng)上述三種處理后,分別對誘導(dǎo)細(xì)胞進行如下檢測：(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測經(jīng)3種誘導(dǎo)處理后的第12d,在倒置熒光顯微鏡下觀察,3組細(xì)胞均由長梭形轉(zhuǎn)變成細(xì)長的成肌細(xì)胞狀態(tài),即細(xì)長管狀,旋渦狀逐漸消失。(2)免疫熒光檢測在上述各組在開始處理后的第8d,利用MyoD 和 Desmin抗體進行檢測,其結(jié)果,雖然3種處理組細(xì)胞的MyoD均呈現(xiàn)陽性表達(dá),但與A和B組相比,C組的MyoD表達(dá)量較低；3種處理組的細(xì)胞均表達(dá)Desmin,且其表達(dá)量無明顯差別；在第16d,利用MyoD、MyoG 和 Desmin抗體進行檢測,在3種處理組的MyoD相對表達(dá)量與第8d檢測時相比均有所下降,MyoG蛋白的表達(dá)量較弱,而Desmin的表達(dá)量與第8d檢測時相比無明顯差異。(3)流式細(xì)胞檢測 采用流式細(xì)胞儀進行檢測結(jié)果,上述3種處理組的細(xì)胞均表達(dá)成肌細(xì)胞特異因子MyoD、Desmin和MyoG,且3種蛋白的陽性細(xì)胞率均達(dá)到86.6%以上(A組分別為98.6%、99.0%和99.0%；B組分別為93.5%、99.5%和97.4%；C組分別為99.3%、99.5%和86.6%)。(4) Real-Time PCR采用Real-Time PC R方法,對上述3種處理組細(xì)胞的MyoD、 MyoG和Desmin的相對表達(dá)量進行檢測,其結(jié)果,與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)化為1)相比,上述3種處理組的MyoD、MyoG和Desmin勺相對表達(dá)量與均升高(A組分別為3.217+0.01倍、4.345+0.01倍和5.107+0.01倍；B組分別為2.046±0.01倍、2.389+0.01倍和5.489+0.01倍；C組分別為3.713+0.01倍、1.861土0.01倍和5.271士0.01倍)。上述結(jié)果表明,本研究利用小鼠MyoD基因構(gòu)建的MyoD-PcDNA3.1真核表達(dá)載體可以誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞,為進一步研究成肌細(xì)胞對肌損傷修復(fù)的作用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

３．３．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)逡逑將冷凍保存綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，進行傳代培養(yǎng)。當(dāng)傳代培養(yǎng)至第２代時，，逡逑呈現(xiàn)長梭形旋禍狀排列（圖３－１），對其續(xù)培養(yǎng)的第２ｄ，細(xì)胞達(dá)到約９０％Ｗ上匯合（圖逡逑３－２）。逡逑WW逡逑圖３－１綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞Ｐ２（５0ｘ）邐圖３－２綿羊廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞Ｐ３（Ｓ0ｘ）逡逑３．３．２綿羊驕帶間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化逡逑３．３．２．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染逡逑為了檢測綿羊廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，實驗采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將逡逑ＭｙｏＤ－ｐｃＤＮＡ３．１質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至綿羊巧帶間充干細(xì)胞，對照組為轉(zhuǎn)染ＧＦＰ質(zhì)粒的細(xì)胞，轉(zhuǎn)逡逑染２４ｈ后觀察綠色巧光的數(shù)量，Ｗ檢測和記錄轉(zhuǎn)染效率。其結(jié)果，２４ｈ后巧光倒置顯微逡逑鏡下可觀察到部分細(xì)胞發(fā)出綠色巧光（圖３－３、圖３－４），４化時巧光數(shù)量增加亮度增強逡逑（圖邋３－５、圖邋３－６）。逡逑－２９－逡逑

３．３．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)逡逑將冷凍保存綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，進行傳代培養(yǎng)。當(dāng)傳代培養(yǎng)至第２代時，逡逑呈現(xiàn)長梭形旋禍狀排列（圖３－１），對其續(xù)培養(yǎng)的第２ｄ，細(xì)胞達(dá)到約９０％Ｗ上匯合（圖逡逑３－２）。逡逑WW逡逑圖３－１綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞Ｐ２（５0ｘ）邐圖３－２綿羊廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞Ｐ３（Ｓ0ｘ）逡逑３．３．２綿羊驕帶間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化逡逑３．３．２．１綿羊巧帶間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染逡逑為了檢測綿羊廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，實驗采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將逡逑ＭｙｏＤ－ｐｃＤＮＡ３．１質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至綿羊巧帶間充干細(xì)胞，對照組為轉(zhuǎn)染ＧＦＰ質(zhì)粒的細(xì)胞，轉(zhuǎn)逡逑染２４ｈ后觀察綠色巧光的數(shù)量，Ｗ檢測和記錄轉(zhuǎn)染效率。其結(jié)果，２４ｈ后巧光倒置顯微逡逑鏡下可觀察到部分細(xì)胞發(fā)出綠色巧光（圖３－３、圖３－４），４化時巧光數(shù)量增加亮度增強逡逑（圖邋３－５、圖邋３－６）。逡逑－２９－逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉忠;李素萍;楊宏友;王震;呂蓉;吳炳;方勤;李敏;吳學(xué)忠;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化成骨細(xì)胞的研究[J];中國輸血雜志;2011年05期

2 周秀娟;黃峻;姚X;周鋒;馬春玲;;MyoD基因誘導(dǎo)大鼠心臟成纖維細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的實驗研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2006年04期

3 Hong Chen;Yan Zhang;Zhijun Yang;Hongtian Zhang;;Human umbilical cord Wharton's jelly-derived oligodendrocyte precursor-like cells for axon and myelin sheath regeneration[J];Neural Regeneration Research;2013年10期

4 解繼勝;黃海玲;唐毓金;陳維平;羅小瓊;;人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及向軟骨細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年16期

5 閆俊卿;韓濤;朱爭艷;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及向類肝細(xì)胞的分化[J];世界華人消化雜志;2008年15期

6 徐若男;施明;王福生;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特征及其臨床應(yīng)用前景[J];中國免疫學(xué)雜志;2010年01期

7 朱少芳;何援利;付霞霏;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和超微結(jié)構(gòu)[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2011年04期

8 藍(lán)建發(fā);羅新;宋泓;石海燕;郭紅宇;;5-氮雜胞苷誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化研究[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2013年06期

本文編號：2539323