【摘要】：卵泡內(nèi)膜細胞凋亡及類固醇生成在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中發(fā)揮了重要作用。褪黑素調(diào)控卵泡內(nèi)膜中凋亡和類固醇生成的具體機制目前還不清楚,該研究對于進一步闡明褪黑素在卵泡發(fā)育和閉鎖中的調(diào)控作用,促進卵泡體外培養(yǎng)和應用具有重要意義。本研究選擇牛3-4 mm卵泡在體外研究褪黑素對卵泡內(nèi)膜細胞類固醇生成及卵泡內(nèi)膜細胞凋亡的影響,并進一步闡明具體的調(diào)控機制。研究結果如下:1.褪黑素對牛卵泡內(nèi)膜細胞凋亡與類固醇生成的影響用0 ng/mL,1 ng/m L,10 ng/m L,100 ng/mL的褪黑素處理卵泡,撕取卵泡內(nèi)膜,RT-qPCR檢測卵泡內(nèi)膜細胞褪黑素受體MT1、MT2的表達,結果顯示10 ng/m L的褪黑素對褪黑素受體MT1、MT2的促進效果最明顯。卵泡培養(yǎng)液中添加10 ng/mL的褪黑素處理,RT-qPCR檢測撕取的卵泡內(nèi)膜LHR,類固醇生成相關基因及凋亡基因BCL2、BAX、CASPASE的表達,Elisa檢測卵泡培養(yǎng)上清中雄烯二酮和孕酮的分泌。結果顯示褪黑素顯著促進LHR和STAR的表達,顯著促進孕酮的分泌,顯著促進抗凋亡基因BCL2的表達,BCL2和BAX比率增加。用10 ng/mL褪黑素處理體外培養(yǎng)的卵泡內(nèi)膜細胞,使用TUNEL染色法檢測細胞的凋亡情況,染色結果顯示褪黑素處理組的凋亡率低于對照組。本研究表明褪黑素影響卵泡中卵泡內(nèi)膜細胞類固醇的生成,抑制卵泡內(nèi)膜細胞的凋亡。2.MT1和MT2介導褪黑素對卵泡內(nèi)膜細胞凋亡與類固醇生成的作用在含有10 ng/m L褪黑素的卵泡培養(yǎng)液中添加10μM褪黑素受體非特異性的抑制劑Luzindole或10μM MT2特異性抑制劑4P-PDOT處理,RT-qPCR檢測撕取的卵泡內(nèi)膜細胞褪黑素受體MT1、MT2和LHR、STAR,抗凋亡基因BCL2的表達,Elisa檢測卵泡培養(yǎng)上清中孕酮的分泌。結果顯示,添加Luzindole后顯著抑制褪黑素誘導的MT1和MT2的表達,添加4P-PDOT后顯著抑制MT2的表達;添加Luzindole或4P-PDOT處理均顯著抑制褪黑素誘導的LHR、STAR、BCl2的表達;添加Luzindole處理顯著抑制孕酮的分泌。本研究表明MT1和MT2介導褪黑素對卵泡內(nèi)膜細胞凋亡和類固醇生成的調(diào)控作用。3.PI3K/AKT通路介導褪黑素對卵泡內(nèi)膜細胞凋亡與類固醇生成的作用在含有10 ng/mL褪黑素的卵泡培養(yǎng)液中添加25μM通路抑制劑LY294002處理,RT-qPCR檢測撕取的卵泡內(nèi)膜細胞LHR、STAR及抗凋亡基因BCL2的表達,Elisa檢測卵泡培養(yǎng)上清中孕酮的分泌。結果顯示添加LY294002處理顯著抑制褪黑素誘導的LHR、STAR和BCL2的表達,添加LY294002處理顯著抑制孕酮的分泌。研究表明PI3K/AKT通路在褪黑素介導卵泡內(nèi)膜細胞凋亡與類固醇生成中起到一定的調(diào)控作用。結論:MT1/MT2和PI3K/AKT信號通路介導褪黑素調(diào)控牛卵泡內(nèi)膜細胞凋亡與類固醇生成。
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第二章 褪黑素的研究進展 成中的作用仍所知甚少。本研究的目的意義本研究在體外條件下利用褪黑素處理牛 3-4 mm 的卵泡，研究褪黑素對卵固醇生成及卵泡內(nèi)膜細胞凋亡的影響，并進一步闡明具體的調(diào)控機制。該步闡明褪黑素在卵泡發(fā)育和閉鎖中的調(diào)控作用，促進卵泡體外培養(yǎng)和應用。

圖 3-1 牛小腔卵泡的分離細胞完整，卵泡內(nèi)膜血管不豐富；B: 卵泡壁顆粒細胞不完整，卵泡內(nèi)膜細胞完整，卵泡內(nèi)膜血管豐富；D: 卵泡壁顆粒細胞不完整，卵泡內(nèi)膜Fig.3-1 The separation of bovine small antral follicleith complete granulosa cells and poor blood vessels; B: Follicles with incom blood vessels; C: Follicles with complete granulosa cells and rich blood vessete granulosa cells and rich blood vessels膜 胞純度鑒定圖 3-1C 所示，健康的沒有明顯凋亡現(xiàn)象的卵泡，分離卵泡內(nèi)胞，使用 RT-PCR 的方法鑒定卵泡內(nèi)膜細胞細胞特異基因及顆（圖 3-2），，鑒定結果顯示分離的卵泡內(nèi)膜表達膜細胞特異基因細胞特異基因 FSHR。膠原酶法分離卵泡內(nèi)膜細胞，體外培養(yǎng)所使用的一抗是 CYP17a1 和 FSHR。鑒定結果顯示膜細胞白，而不表達 FSHR 蛋白(圖 3-3)，統(tǒng)計結果顯示膜細胞的陽
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823

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1 王曉梅;褪黑素對牛卵泡內(nèi)膜細胞凋亡和類固醇生成的作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2017年

本文編號：2535929