【摘要】：驗(yàn)證基于革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)(Gram-positive enhancer matrix,GEM)展示口蹄疫病毒細(xì)菌樣顆粒(Bacteria-like particles,BLP)疫苗的可行性。按照大腸桿菌偏好性密碼子優(yōu)化合成基于豬口蹄疫病毒Mya98株序列的3種抗原基因設(shè)計(jì),并將其插入到含有錨鉤蛋白基因的原核表達(dá)載體p QZ-PA,鑒定陽(yáng)性后轉(zhuǎn)入Escherichia coli BL21,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。利用SDS-PAGE與Western blotting對(duì)目的基因表達(dá)及產(chǎn)物的可溶性進(jìn)行分析。利用GEM顆粒純化目的蛋白,制備細(xì)菌樣顆粒疫苗抗原;利用BCA試劑盒測(cè)定重組蛋白的濃度,將重組蛋白與白油佐劑乳化,制備疫苗,免疫5周齡小鼠,同時(shí)設(shè)商品化多肽苗對(duì)照與空白對(duì)照,免疫后不同時(shí)間采集試驗(yàn)小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和O型口蹄疫抗體液相阻斷酶聯(lián)免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫小鼠血清的抗體水平;利用噻唑藍(lán)比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖情況;利用熒光定量PCR方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá),評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫水平。SDS-PAGE結(jié)果表明,設(shè)計(jì)在大腸桿菌中的3種口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式獲得高效表達(dá);Western blotting結(jié)果顯示,表達(dá)的重組蛋白能夠與口蹄疫病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),利用GEM顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)重組蛋白的一步離心純化,制備BLP疫苗抗原;免疫試驗(yàn)結(jié)果表明,設(shè)計(jì)的重組抗原B(T1BT2)4B不但能夠刺激免疫小鼠產(chǎn)生更高水平的多肽特異性ELISA抗體與口蹄疫特異性液相阻斷抗體,而且產(chǎn)生了更高水平的脾淋巴細(xì)胞增殖及Th1型的細(xì)胞因子分泌。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本研究制備的BLP疫苗GEM-B(T1BT2)4B具有良好的免疫原性,為研究口蹄疫病毒基因工程亞單位疫苗開辟了一條新的思路。
【圖文】：

ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechFebruary25,2017Vol.33No.2http://journals.im.ac.cn/cjbcn222預(yù)期設(shè)計(jì)的目的基因片段一致。2.2重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)，在含有氨芐青霉素的LB平上挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)。取菌到含有氨芐青霉素的LB體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)到細(xì)菌濃度達(dá)到OD600為0.51時(shí)加終濃度為0.4mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)24h后，菌離去培養(yǎng)基，用PBS重懸菌體后經(jīng)高壓破碎儀破碎菌體，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物(圖1)，3個(gè)融合蛋白都可以表達(dá)，分子分約為47、28與36kDa，^u且3個(gè)蛋白均以可溶性形式存在于菌體破碎的上清中。圖1重組蛋白表達(dá)及可溶性分析結(jié)果Fig.1ExpressionandsolubilityidentificationoftherecombinantproteinwithSDS-PAGE.M:proteinmolecularmarker;1:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;2:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-B(T1BT2)4B-PA;3:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-B(T1BT2)4B-PAtransformedBL21;4:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-B(T1BT2)4B-PAtransformedBL21aftersupersonic;5:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;6:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT1B-PA;7:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21;8:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21aftersupersonic;9:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;10:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;11:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;12:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21aftersuperson

PAtransformedBL21;8:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21aftersupersonic;9:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;10:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;11:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;12:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21aftersupersonication.2.3重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的Westernblotting鑒定經(jīng)SDS-PAGE泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用鼠抗O型FMDV肽陽(yáng)性血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物徻行Westernblotting鑒定，結(jié)果如圖2所示，在PVDF膜上獲得的帶與SDS-PAGE表達(dá)的蛋白帶一致，這表明表達(dá)的重組蛋白可被特異性的抗體所識(shí)，具有較好的抗原性。2.4GEM純化目的蛋白的SDS-PAGE鑒定如圖3所示，，用SDS-PAGE可檢測(cè)到較高純度目的蛋白的存在，純化后pQZ-BT1B-PA重組蛋白濃度為85μg/mL；純化后pQZ-BT2B-PA重組蛋白濃度為213μg/mL；純化后pQZ-B(T1BT2)4B-PA重組蛋白濃度為870μg/mL；用透鏡觀察可見，與未結(jié)合前的GEM比，結(jié)合重組蛋白后的GEM顆粒有很不壝則的細(xì)成團(tuán)結(jié)合物，可是蛋白形成了聚體(圖4)。圖2重組蛋白的Westernblotting鑒定結(jié)果Fig.2Westernblottinganalysisofrecombinantprotein.M:proteinmolecularmarker;1:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;2:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT1B-PA;3:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21;4:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;5:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;6:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-B(T1BT2)4B-PA;7:supernatantofsupersonicated
【作者單位】： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院;國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心;江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心;
【基金】：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(No.201303046) 江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新專項(xiàng)(No.CX(14)2089)資助~~
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2535095