【摘要】：狂犬病又稱恐水病,是由狂犬病病毒引起的、迄今為止人類唯一病死率幾乎高達100%的人畜共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病,嚴重威脅人們的生命安全。目前為止,狂犬病尚無有效的治療方法。狂犬病疫苗的緊急預防接種是預防狂犬病病毒感染的最有效方法之一。目前,我國動物使用的狂犬病疫苗主要是弱毒活疫苗。但由于弱毒苗存在毒力回復、突變等潛在的安全隱患問題,WHO曾表明家養(yǎng)動物不適合用弱毒苗免疫。所以,要防治狂犬病的發(fā)生重要的是研制出更安全有效的疫苗。腺病毒活載體疫苗因其自身的優(yōu)越性和應用的廣泛性,已被應用于狂犬病基因工程疫苗的研究。鞭毛蛋白是鞭毛的主要組成成分。它不僅在細菌運動方面起著重要作用,而且也可以與表達于上皮細胞、單核細胞和未成熟的樹突狀細胞的頂端和基底外側(cè)的TLR5受體結(jié)合,從而誘導分泌前炎性因子和細胞因子,介導激活T細胞和B細胞應答。因此,鞭毛蛋白可以作為疫苗佐劑,增強疫苗的免疫效果,具有良好的應用前景。本試驗成功表達并純化了鞭毛蛋白FljB、FliC和FljB’-FliC。純化的蛋白與狂犬病毒滅活疫苗(whole-killed rabies vaccine,WKRV)一起免疫小鼠。小鼠共五組:((1)PBS;(2)WKRV;(3)WKRV和10μg FljB;(4)WKRV和10μg FliC;(5)WKRV和10μg FliB’-FliC。每組10只小鼠,每隔兩周進行一次免疫,共免疫兩次。在免疫后0天、7天、14天、21天、28天和35天采血,通過ELISA的方法檢測抗體水平。用ELISPOT的方法檢測細胞因子IL-4和IFN-γ的變化�？贵w結(jié)果表明:FljB有望成為WKRV的佐劑;免疫了FliC后能夠提高免疫反應,但效果不明顯;FljB’-FliC不能提高WKRV的體液免疫反應。細胞因子檢測結(jié)果表明:FljB誘導產(chǎn)生的Th1和Th2免疫反應要強于FliC;FliB’-FliC不能增強細胞免疫反應。本試驗采用腺病毒表達系統(tǒng),構(gòu)建了表達狂犬病毒G蛋白、G蛋白與鞭毛蛋白FljB和G蛋白與FliC的復制缺陷型重組腺病毒Ad-G、Ad-GB和Ad-GC。用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠,每隔兩周免疫一次,共免疫三次。在免疫后0天、14天、28天、35天和42天采血,通過間接ELISA的方法檢測狂犬病毒G蛋白的抗體IgG水平。通過ELISPOT的方法檢測細胞因子IL-4和IFN-γ的變化。用FCM進行了CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞的檢測�？贵w檢測結(jié)果表明:FljB和FliC均有增強體液免疫的作用,并且FljB比FliC的效果好。細胞因子檢測結(jié)果表明:FljB和FliC均有增強細胞免疫的作用,并且FljB比FliC的效果好。FCM檢測結(jié)果表明:FljB和FliC均能夠增強誘導Th和Tc細胞的增殖。綜上所述,鞭毛蛋白FljB和FliC無論是在狂犬病毒滅活疫苗中還是在腺病毒共表達G蛋白和鞭毛蛋白的基因工程疫苗中,均有免疫增強作用。并且,FljB總體上來說比FliC的增強效果更顯著。表明了FljB有望成為狂犬病疫苗的佐劑,從而為研制安全、高效的狂犬病疫苗提供一定的參考作用。
【圖文】：

現(xiàn)癥狀的人可以通過實驗室診斷來檢測是否患狂犬病，比如，用直接熒光抗體檢測膚活檢樣本中的 RABV，用 RT-PCR 檢測唾液，用抗體檢測血清或腦脊液。對動物樂死動物的腦組織樣本可以通過直接熒光抗體檢測的方法來檢測 RABV。除了在公工作的人，大多數(shù)人很難有機會進行狂犬病檢測。然而，作為預防獸醫(yī)工作者，應的診斷實驗是有用的以及在診斷病毒時需要什么樣的樣本。記住一些關(guān)于狂犬病的的治療以及保護身邊人的安全都是很有幫助的。 狂犬病病毒研究 病毒粒子的結(jié)構(gòu)特點犬病病毒（rabies virus, RABV）是單股負鏈不分節(jié)段的 RNA 病毒，含有囊膜，屬(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus)，具有嗜神經(jīng)性( Mayo et al., 2006; Ros)。電鏡下觀察，RABV 成熟的病毒粒子直徑約 75 nm，不同的毒株病毒粒子長度有約 170~180 nm，一端平凹，另一端鈍圓，形狀呈典型的子彈狀結(jié)構(gòu) ( King et al., 1-2 所示。病毒粒子由脂質(zhì)雙層外膜、基因組 RNA 和核蛋白、衣殼基質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄以及包膜基質(zhì)蛋白 5 種結(jié)構(gòu)蛋白組成。

中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言的排列順序為 3'-N-P-M-G-L-5'�；蚪M中約 91%的核苷酸編碼結(jié)構(gòu)蛋白，由 3′ 端 poly(A)～5′端 AACA 分別編碼病毒核蛋白（Nucleoprotein）、磷蛋白（phosphoprotein）、膜基質(zhì)蛋白（matrixprotein）、糖蛋白（glycoprotein）和依賴 RNA 的 RNA 多聚酶(RNA polymerase, L)( Tordo et al.,1998 )，基因長度分別為 1424 bp，991 bp，804/805 bp，1675 bp、6475/6476 bp，對應的 ORF 大小依次為 1353 bp，894 bp，609 bp，1575 bp，6429 bp ( 韋平等, 2008 )。RABV 編碼的五個結(jié)構(gòu)蛋白中糖蛋白(G)是存在病毒顆粒表面的唯一的蛋白質(zhì)，以三聚體形式存在，，可與細胞受體結(jié)合，是 RABV 的主要保護性抗原，能誘導機體體液免疫的產(chǎn)生和刺激 T 細胞作用產(chǎn)生細胞免疫。當前無論是人用狂犬病疫苗還是獸用疫苗的效價主要取決于疫苗制劑中糖蛋白的含量。RABV 和其他彈狀病毒的辨別有賴于非編碼區(qū)的差異( Wunner et al., 1988 )。病毒在感染宿主細胞后會在 3′端非編碼區(qū)產(chǎn)生一個由 58 個核苷酸組成的先導序列，該序列在復制過程中不翻譯；編碼核蛋白、磷蛋白、膜基質(zhì)蛋白、糖蛋白和依賴 RNA 的 RNA 多聚酶的各結(jié)構(gòu)基因之間含有不同長度的不轉(zhuǎn)譯間隔區(qū)，間隔區(qū)大小分別為 2、5、5、423 nt( Wunner et al., 1988 )；在基因組的 5′端非編碼區(qū)是一個 70 個核苷酸組成的非轉(zhuǎn)錄序列（見圖 1-3）。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

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本文編號：2532213