【摘要】：犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)首次于1967年從患呼吸道疾病的犬中分離獲得,是犬窩咳的主要病因之一。臨床表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕等呼吸道癥狀。當(dāng)與細(xì)菌、病毒等混合感染時,可引起犬的死亡。血清學(xué)調(diào)查表明CPIV在世界各國普遍流行�，F(xiàn)有的關(guān)于CPIV流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,在犬以及其他野生動物的血清樣品中,CPIV的陽性率較高。由于CPIV長期困擾著養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展,所以需要一種準(zhǔn)確、簡便的診斷方法來對該病作出準(zhǔn)確診斷。CPIV的NP蛋白是核衣殼蛋白的主要成分,與病毒RNA直接結(jié)合,高度保守,在病毒感染時可引起強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。通過RT-PCR擴(kuò)增NP基因,并將NP基因克隆到p ET-30a載體,然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-NP,并對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序鑒定。利用IPTG對重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得重組蛋白NP。對重組蛋白NP進(jìn)行純化鑒定,SDS-PAGE的試驗(yàn)結(jié)果顯示,重組蛋白NP的分子量與預(yù)期大小相符;Western blot的試驗(yàn)結(jié)果顯示,重組蛋白NP能與CPIV陽性血清發(fā)生反應(yīng)。使用純化的重組NP蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠,將SP2/0細(xì)胞與經(jīng)過免疫鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。用CPIV作為包被抗原,建立間接ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)過篩選得到3株陽性雜交瘤細(xì)胞株,能穩(wěn)定分泌單克隆抗體,命名為2F1、3B9、4D11。Western blot試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)結(jié)果顯示,3株陽性雜交瘤細(xì)胞上清均可以同CPIV發(fā)生特異性反應(yīng)。將4D11雜交細(xì)胞株腹腔注射小鼠,獲取腹水,測得腹水效價為1:104。本研究以CPIV作為檢測抗原,以4D11單克隆抗體作為競爭抗體,建立競爭ELISA檢測方法并且對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件。利用已建立的競爭ELISA檢測方法檢測77份CPIV犬陽性血清,根據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法計算得到陽性臨界值為15.1%。該方法與犬細(xì)小病毒(CPV)血清、犬瘟熱病毒(CDV)血清無交叉反應(yīng),表明該檢測方法具有良好的特異性;批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為1.30%~5.29%,批間變異系數(shù)為1.18%~8.55%,表明該檢測方法具有較好的重復(fù)性。分別使用建立的競爭ELISA方法和血凝抑制試驗(yàn)對153份血清進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示符合率為92.16%。本實(shí)驗(yàn)建立了CPIV抗體的競爭ELSA檢測方法,優(yōu)化了試驗(yàn)條件,為CPIV的快速診斷、流行病學(xué)的調(diào)查與免疫抗體監(jiān)測提供了技術(shù)支持。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2528159