【摘要】：埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever,EHF)和馬爾堡出血熱(Marburg hemorrhagic fever,MHF)分別是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)引起的以急性,發(fā)熱并伴有嚴(yán)重出血為癥狀的人獸共患烈性傳染病。EBOV和MARV同屬絲狀病毒科,它們是目前人類所知最致命的病原之一,其致死率可高達(dá)90%,嚴(yán)重威脅著公眾健康和國家生物安全,同時(shí)也是重要的生物武器及生物反恐防范對象。雖然EHF和MHF主要流行于非洲地區(qū),我國尚未發(fā)現(xiàn)該病,但隨著日益密切的國際貿(mào)易和人員流動(dòng),該病傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)日益增高。研究證明使用疫苗可有效預(yù)防和控制該病的傳播和危害,因此開展EBOV和MARV的儲備性疫苗研究對我國具有十分重要的公共衛(wèi)生和生物安全意義。本研究在水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)反向遺傳操作平臺的基礎(chǔ)上,通過限制性酶切位點(diǎn)改造,成功建立了嵌合型VSV反向遺傳操作平臺,將VSV基因組中自身囊膜糖蛋白G替換為ZEBOV,SEBOV或MARV的囊膜糖蛋白GP并成功拯救出重組病毒,分別命名為rVSV?G/ZEBOVGP,rVSV?G/SEBOVGP和rVSV?G/MARVGP。Western Blot和間接免疫熒光試驗(yàn)表明三種重組病毒的GP蛋白均能夠正確表達(dá)且定位于細(xì)胞膜表面,免疫電鏡結(jié)果表明GP嵌合在重組病毒粒子表面,重組病毒呈現(xiàn)典型的子彈狀形態(tài)特征。進(jìn)一步在小鼠上進(jìn)行三種病毒的安全性評價(jià),在觀察期內(nèi)小鼠未表現(xiàn)明顯的體重下降和任何臨床癥狀,初步表明三種重組病毒對小鼠具有良好的安全性。為了評估重組病毒對小鼠的免疫原性,將三種病毒以單獨(dú)(1×106pfu)或三重聯(lián)合(每種病毒1×106 pfu)經(jīng)肌肉注射途徑接種小鼠,初次免疫3周后用相同劑量加強(qiáng)免疫。利用ELISA和中和試驗(yàn)測定小鼠血清特異性抗體水平。結(jié)果顯示,一次免疫后小鼠即能產(chǎn)生較高水平的GP特異性IgG和中和抗體,加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著上升。表明三種重組病毒在小鼠上具有良好的免疫原性。本研究在國內(nèi)首次成功構(gòu)建了以嵌合型VSV為載體的幾種重要烈性外來出血熱病毒儲備性疫苗,并證明這幾種疫苗無論單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均對小鼠安全,且能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平中和抗體。本研究結(jié)果表明rVSV?G/ZEBOVGP,rVSV?G/SEBOVGP和rVSV?G/MARVGP作為防控EBOV和MARV的儲備性疫苗具有潛在應(yīng)用價(jià)值。重組病毒在非人靈長類動(dòng)物(Nonhuman primates,NHPs)上的安全性和有效性需要進(jìn)一步評估。
[Abstract]:Ebola hemorrhagic fever (Ebola hemorrhagic fever,EHF) and Marburg hemorrhagic fever (Marburg hemorrhagic fever,MHF) are human and animal infectious diseases characterized by acute, febrile and severe bleeding caused by Ebola virus (Ebola virus,EBOV) and Marburg virus (Marburg virus,MARV), respectively. EBOV and MARV belong to the filamentous virus family, which are one of the deadliest pathogens known to human beings, and their fatality rate can be as high as 90%. It is a serious threat to public health and national biosafety, but also an important biological weapons and biological counter-terrorism prevention target. Although EHF and MHF are mainly popular in Africa, the disease has not yet been found in China, but with the increasing international trade and mobility of people, the risk of the disease entering China is increasing day by day. Studies have proved that the use of vaccines can effectively prevent and control the spread and harm of the disease, so the study of EBOV and MARV reserve vaccines is of great significance to public health and biosafety in China. In this study, based on the reverse genetic operation platform of vesicular stomatitis virus (Vesicular stomatitis virus,VSV), a chimeric VSV reverse genetic operating platform was successfully established by restriction endonuclease modification. The envelope glycoprotein G in VSV genome was replaced with the envelope glycoprotein GP of ZEBOV,SEBOV or MARV, and the recombinant virus was successfully saved, named rVSV?G/ZEBOVGP, respectively. RVSV?G/SEBOVGP, rVSV?G/MARVGP.Western Blot and indirect immunofluorescence assay showed that the GP proteins of the three recombinant viruses could be correctly expressed and located on the surface of cell membrane. The results of immunoelectron microscope showed that GP chimerized on the surface of recombinant virus particles, and the recombinant virus showed typical bullet morphology. The safety of the three viruses was further evaluated in mice. During the observation period, the mice did not show obvious weight loss and any clinical symptoms, which preliminarily showed that the three recombinant viruses were safe in mice. In order to evaluate the immunogenicity of the recombinant virus to mice, the three viruses were inoculated by intramuscular injection (1脳106pfu) or triple combination (1 脳 106pfu per virus). After the first immunization for 3 weeks, the mice were immunized with the same dose. The serum specific antibody level of mice was measured by ELISA and neutralization test. The results showed that mice could produce high levels of GP specific IgG and neutralizing antibody after one immunization, and the antibody level increased significantly after enhanced immunization. The results showed that the three recombinant viruses had good immunogenicity in mice. In this study, several important virulent hemorrhagic fever virus storage vaccines with chimeric VSV as vector were successfully constructed in China for the first time, and it was proved that these vaccines were safe for mice and could induce the production of high levels of neutralizing antibodies. The results of this study show that rVSV?G/ZEBOVGP,rVSV?G/SEBOVGP and rVSV?G/MARVGP have potential application value as reserve vaccines for prevention and control of EBOV and MARV. The safety and effectiveness of recombinant viruses in non-human primates (Nonhuman primates,NHPs) need to be further evaluated.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2505193