發(fā)布時間：2019-05-06 23:57

【摘要】：卵母細胞發(fā)生、發(fā)育和成熟是現(xiàn)代生殖生物學研究的核心和基礎,其中,卵母細胞的成熟是生殖發(fā)育研究的難點和重點。影響卵母細胞成熟的因素很多,其中卵母細胞周圍的卵丘細胞是影響卵母細胞成熟的核心要素,裸卵是指周圍未經(jīng)卵丘細胞完整包裹的卵母細胞,尚未被利用,是一種潛在的卵源。裸卵體外成熟率及后續(xù)發(fā)育潛力較低。目前未見裸卵體外成熟獲得個體的報道,這不僅制約著裸卵體外成熟培養(yǎng)的進一步發(fā)展,也制約著卵母細胞資源的充分利用。Forskolin能夠抑制卵母細胞減數(shù)分裂的恢復,而PD166285能夠推動MPF的合成,從而促進減數(shù)分裂的恢復。紡錘體的組裝及皮質顆粒的分布可作為評價卵母細胞質量的指標。哺乳動物卵母細胞的發(fā)生,是一個極為復雜的細胞分化過程,易受到外界環(huán)境的影響。應激尤其是熱應激對個體產(chǎn)生的最大問題之一就是它對生殖功能的損傷作用。但是熱應激對卵母細胞質量,卵丘細胞包裹、凋亡情況以及裸卵的產(chǎn)生關系未見相關報道。因此,本研究以小鼠為研究對象,通過短時添加forskolin以抑制胞核成熟進程,再添加PD166285促進減數(shù)分裂恢復,觀察forskolin及PD166285對卵母細胞成熟效率,并檢測成熟卵母細胞的皮質顆粒分布及紡錘體組裝,觀察其對卵母細胞質量的影響。并通過IVF-ET進一步檢測體外成熟裸卵的后續(xù)發(fā)育能力。并對小鼠進行熱應激處理,通過蘇木精伊紅染色法及TUNEL細胞凋亡檢測法觀察卵巢上卵母細胞包裹的卵丘細胞的衰退與凋亡的情況,試圖揭示熱應激與小鼠卵巢內卵母細胞質量衰退,裸卵產(chǎn)生之間的聯(lián)系。具體試驗和結果如下:試驗一目的是探討添加forskolin及PD166285對裸卵成熟效率及皮質顆粒分布、紡錘體組裝影響。將體外取得的未成熟的GV期裸卵隨機分配為添加forskolin、PD及不添加兩組。統(tǒng)計不同成熟方式下裸卵的成熟率,隨后檢測成熟卵母細胞紡錘體組裝及皮質顆粒分布。結果發(fā)現(xiàn),加藥組不加藥組均能完成體外成熟過程,加藥組裸卵體外成熟率高于不加藥組;對照組卵母細胞,其紡錘體呈對稱的“紡錘形”。不加藥組紡錘體結構松散,呈“桶狀”分布,體內成熟組,皮質顆粒皮層分布模式所占比例顯著高于體外成熟各組。以上結果說明,添加forskolin及PD166285能夠提高裸卵的體外成熟率,并對成熟卵母細胞質量有一定提升。試驗二旨在探明裸卵通過體外成熟受精后生產(chǎn)小鼠的可能。將卵巢上獲取的裸卵體外加藥培養(yǎng)成熟,并通過體外授精技術使其受精并發(fā)育到2-細胞期后,將2-細胞胚胎通過輸卵管胚胎移植法移入假孕0.5dpc的受體雌鼠體內,并使其繼續(xù)發(fā)育。我們通過本試驗首次獲得了由裸卵體外成熟受精生產(chǎn)出的小鼠。證明裸卵具有發(fā)育為個體的潛力。試驗三旨在揭示熱應激與小鼠卵巢內卵母細胞質量衰退及裸卵的產(chǎn)生之間的聯(lián)系。將小鼠均分為HS-12d、HS-9d、HS-6d、HS-3d及CON五組,每組12只,分別對其進行頻率和時間不同的高強度熱應激。處理完成后,制作卵巢石蠟切片。利用HE染色及TUNEL細胞凋亡檢測觀察小鼠卵巢內卵母細胞個數(shù)及其包裹的卵丘細胞的衰退與凋亡情況。結果發(fā)現(xiàn),對照組卵母細胞個數(shù)顯著高于各熱處理組,差異均顯著(P0.05)。卵巢上周圍卵丘細胞包裹2-5層的卵母細胞數(shù)量,對照組要顯著高于其與各實驗組(P0.05)。TUNEL凋亡檢測顯示,對照組凋亡率要顯著低于各熱應激處理組,差異均顯著(P0.05)。結果表明,熱應激會導致裸卵的產(chǎn)生。綜上所述,本文通過裸卵體外成熟過程中與forskolin、PD166285共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)添加forskolin及PD166285能夠提高裸卵的體外成熟率,并對成熟卵母細胞質量有一定提升,同時證明紡錘體的組裝及皮質顆粒分布可用于評價卵母細胞胞質質量。為后續(xù)提高裸卵的成熟率及卵母細胞胞質檢測提供一定的參考。再通過體外受精-胚胎移植首次獲得了由裸卵體外成熟受精得到的具有正常功能的后代小鼠。證明了裸卵在適當條件下也具有繁殖后代的潛能,為畜禽生產(chǎn)提供更為廣闊的卵母細胞來源,同時也為治療現(xiàn)代不孕不育提供一定幫助。并進一步研究了熱應激對哺乳動物卵巢衰退及裸卵的產(chǎn)生、卵母細胞質量的影響,對裸卵的產(chǎn)生機理進行初步探討。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S814

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本文編號：2470598