發(fā)布時(shí)間：2019-03-31 08:08

【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒自首次分離至今,己在全世界廣泛傳播,不但給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失,而且還嚴(yán)重危害人類健康。為了控制禽流感的傳播,禽流感疫苗被廣泛的應(yīng)用。但是由于禽流感病毒的RNA聚合酶缺乏校對機(jī)制,造成了禽流感病毒基因組RNA遺傳上的不穩(wěn)定性,變異率極高,而疫苗選擇壓更是會(huì)加速流感病毒的抗原變異,引起免疫失敗,甚至引發(fā)新的流行。本文中,我們用A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)禽流感病毒疫苗株(簡稱F株)免疫小鼠,成功制備五株針對F株的H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體,利用這5株單克隆抗體,檢測了本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得的有和無同源疫苗抗體選擇壓下病毒的抗原變化,發(fā)現(xiàn)隨著傳代代次的增加,病毒的血凝抑制效價(jià)顯著下降：并且同源疫苗抗體下傳代病毒的血凝抑制效價(jià)下降得更早,表明同源疫苗抗體加速了流感病毒的抗原變異；進(jìn)一步研究表明,有一株單克隆抗體可能是針對F株的181位氨基酸所在的抗原表位的單抗。本論文的研究結(jié)果將為H9N2亞型禽流感病毒的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供一定的資源。1、H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體的制備經(jīng)10日齡SPF雞胚擴(kuò)增的F株病毒尿囊液差速離心后獲得純化的F株病毒,將純化的病毒蛋白作為免疫原,免疫6-8周齡的BALB/c小鼠；通過雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)過三次間接ELISA篩選融合陽性細(xì)胞；隨后用有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行三次亞克隆,獲得五株能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1D6、3G8、4A5、6B11和6C12。五株單克隆抗體的腹水效價(jià)分別為29、212、27、214、29,腹水的ELISA效價(jià)分別為1.0×105、1.6×106、3.2×106、3.2×106、2.0×105。特異性試驗(yàn)顯示五株單克隆抗體與H9亞型禽流感病毒發(fā)生血凝抑制(HI)反應(yīng),與H5亞型禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒、新城疫病毒無任何交叉反應(yīng),證明本論文獲得的5株五株單克隆抗體具有良好的特異性：Western blot結(jié)果顯示五株單克隆抗體在75kd處出現(xiàn)特異的HA條帶,表明這五株單克隆抗體均為針對H9N2亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的單抗。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明,這五株單克隆抗體可以用于免疫組織化學(xué)方法檢測攻毒雞氣管組織中存在的H9N2亞型禽流感病毒。2、單克隆抗體在抗原變異上的初步應(yīng)用在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室用F株在有和無同源疫苗抗體選擇壓的SPF雞胚模型中進(jìn)行連續(xù)傳代,收集了第15代、30代、47代、50代和52代病毒。為研究同源疫苗選擇壓對禽流感病毒抗原變異的作用,本實(shí)驗(yàn)首先用5株單克隆抗體比較了有和無同源疫苗抗體選擇壓下同代次病毒的血凝抑制效價(jià)。發(fā)現(xiàn)隨著傳代代次的增加,病毒的血凝抑制效價(jià)顯著下降；并且有同源疫苗抗體下傳代的病毒血凝抑制效價(jià)下降得更早,表明同源疫苗抗體加速流感病毒的抗原變異。本實(shí)驗(yàn)室前期分析抗原變異的傳代病毒的序列發(fā)現(xiàn),其HA基因有4個(gè)氨基酸的突變。為探討HA的氨基酸位點(diǎn)在抗原變異中的作用,本論文通過RT-PCR,基因克隆等分子生物學(xué)方法,分別構(gòu)建了含有K131R、S145N、G181E和A198V四個(gè)突變(稱為rFHA1)、 K131R、G181E和A198V三個(gè)突變(稱為rFHA2)、以及G181E一個(gè)突變的HA(稱為rFHA181),將這三種HA插入pCAGGS哺乳動(dòng)物載體中,分別稱為pCA-rFHA1、 pCA-rFHA2、pCA-rFHA181;然后分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中表達(dá)HA蛋白；用本論文獲得的單克隆抗體經(jīng)ELISA檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示單抗1D6與F株反應(yīng)良好,但是與pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181三種蛋白都不反應(yīng),其余四株單抗與pCA-rFHA1、pCA-rFHA2、pCA-rFHA181的ELISA效價(jià)水平較高。結(jié)果表明,單抗1D6的表位可能位于HA的181位,說明HA的181位在抗原的變異中有一定的作用。由于本論文獲得的單克隆抗體的株數(shù)有限,沒有對其余三個(gè)突變進(jìn)行定性,還有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4

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