【摘要】：乳酸菌是公認(rèn)的安全級(generally recognized as safe,GRAS)微生物,是動物腸道內(nèi)重要的常在菌群,對維持腸道菌群平衡、改善便秘、防止腹瀉以及提高機體免疫力具有重要作用。基于乳酸菌的多種益生特點,使其成為傳遞與表達外源抗原蛋白,進行腸道免疫的的重要宿主候選菌株。目前,乳酸菌級表達載體多以誘導(dǎo)型為主,由于表達異源蛋白的產(chǎn)量較低且不利于生產(chǎn)實踐,從而限制了其應(yīng)用。通過改造控制基因表達的順式作用元件是提高蛋白表達量的有效途徑,而啟動子在細(xì)菌轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中居于關(guān)鍵地位,因此穩(wěn)定且可持續(xù)表達目的蛋白的組成型啟動子是構(gòu)建表達載體非常重要的表達元件。本研究以干酪乳桿菌為研究對象,通過干酪乳桿菌基因組c DNA微陣列分析,以尋找適用于異源蛋白表達的組成型啟動子。將干酪乳桿菌在分別以葡萄糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和棉籽糖為碳源的MRS培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)接5次,提取細(xì)菌總RNA進行反轉(zhuǎn)錄,以16S RNA作為管家基因,進行全基因組c DNA微陣列分析。分析結(jié)果顯示,以上述八種糖為碳源,干酪乳桿菌丙酮酸水合酶(enolase)基因皆為高表達基因,據(jù)此我們推測干酪乳桿菌丙酮酸水合酶基因含有組成型啟動子。通過分析丙酮酸水合酶基因的上游基因序列并結(jié)合生物信息學(xué)軟件確定了兩段假定啟動子序列,分別命名為P776和P342。分別將P776和P342與報告基因EGFP連接,然后連接到去除啟動子的表達質(zhì)粒pPG-T7g10-PPαT中,獲得重組表達質(zhì)粒pPG-P342EGFP和p PG-P776EGFP。為了驗證所預(yù)測啟動子的強弱,與原表達質(zhì)粒pPG-T7g10-PPαT的HCE啟動子進行了比較,將EGFP編碼基因連入表達質(zhì)粒pPG-T7g10-PPαT中,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pPG-T7g10-EGFP。分別將重組表達質(zhì)粒pPG-P342EGFP、pPG-P776EGFP和p PG-T7g10-EGFP經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入Lactobacillus(L)casei 393感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建了重組菌pPG-P776EGFP/L.casei 393、pPG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-T7g10-EGFP/L.casei 393,通過Western blot、熒光定量PCR、流式細(xì)胞技術(shù)及激光共聚焦等方法,檢測報告基因EGFP的表達情況。構(gòu)建的重組乳酸桿菌表達結(jié)果顯示,由不同啟動子組成的三株重組乳酸菌經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察均可看到綠色熒光,Western blot檢測EGFP獲得了正確表達,大小約26k Da,說明預(yù)測的P342和P776均具有啟動子活性。為比較P342和P776與原表達載體HCE啟動子的活性強弱,提取對數(shù)生長期的三株重組菌RNA,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物c DNA為模板及氯霉素(Cm)基因為管家基因,進行相對定量PCR,實驗結(jié)果顯示,HCE:P342:P776 3種啟動子的效率比分別為1:0.8:1.8;Western blot相對定量結(jié)果顯示,三株重組菌中,p PG-P776EGFP/L.casei393目的蛋白的表達量最大;流式細(xì)胞檢測顯示,L.casei 393、p PG-P342EGFP/L.casei 393、pPG-P776EGFP/L.casei 393和pPG-T7g10-EGFP/L.casei 393的熒光強度分別為30.2%、38.5%、52.2%和45.2%;將p PG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-P776EGFP/L.casei 393分別培養(yǎng)12h、18h、24h、30h和36h,Western blot檢測顯示,P342和P776啟動子均可持續(xù)啟動蛋白表達,培養(yǎng)24h時蛋白的表達量最大;分別以葡萄糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和棉籽糖為碳源培養(yǎng)p PG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-P776EGFP/L.casei393,經(jīng)Western blot檢測,結(jié)果顯示組成型啟動子P342和P776在不同糖類為碳源的培養(yǎng)基中均能啟動報告基因EGFP的表達,其中P776啟動子活性強于HCE啟動子,本研究為構(gòu)建乳酸菌級高效表達載體奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.6

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本文編號：2447144