發(fā)布時(shí)間：2019-03-10 18:28

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)的主要病原體是豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),它主要引起仔豬的臨床病理特征是嘔吐、水樣腹瀉和脫水。各生長(zhǎng)階段的豬均易感染PEDV,其中未斷奶仔豬的發(fā)病率高達(dá)100%,十日齡以?xún)?nèi)的感染仔豬病死率為80%～100%。感染豬只雖然能夠存活,但是抵抗力下降,會(huì)導(dǎo)致其他相關(guān)疾病的混合感染。該病的爆發(fā)流行對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV的主要靶器官是仔豬小腸上皮,而在仔豬小腸上皮下廣泛的分布著大量的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs),樹(shù)突狀細(xì)胞是目前已知的哺乳動(dòng)物機(jī)體中功能最為強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC),它不僅在監(jiān)視和抵御病毒入侵的過(guò)程中起到重要作用,同時(shí)還可以激活機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)以體外分離培養(yǎng)的豬單核源樹(shù)突狀細(xì)胞(Monocyte derived dendritic cells,Mo-DCs)和腸道樹(shù)突狀細(xì)胞為主要研究對(duì)象,通過(guò)體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證PEDV弱毒株CV777及其滅活毒與仔豬樹(shù)突狀細(xì)胞的相互作用,以此來(lái)探討PEDV弱毒株CV777及其滅活毒對(duì)仔豬樹(shù)突狀細(xì)胞主要免疫功能的影響,為研究PED的發(fā)病機(jī)制以及PEDV疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。1豬單核源DCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定DCs作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞,是唯一能夠激活初始T細(xì)胞的一類(lèi)異質(zhì)性細(xì)胞。它對(duì)于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、連接先天性免疫和獲得性免疫起到重要的紐帶作用。但是,DCs在機(jī)體中的含量是極少的,這對(duì)于DCs的研究十分不利。所以建立一套成熟的體外分離、誘導(dǎo)、培養(yǎng)豬DCs的方法模型就顯得十分重要。由于豬DCs沒(méi)有特異性的表面標(biāo)志,因此我們只能從分離得到細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、相關(guān)表面分子的鑒定以及生物學(xué)活性三個(gè)方面綜合起來(lái)對(duì)分離培養(yǎng)出來(lái)的樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞有典型的樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài),我們選取的表面分子:SWC3a~+CD1a~+、SWC3a~+CD80/86~+、SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+ 的表達(dá)量分別可以達(dá)到58.95%、72.31%和13.39%,未成熟Mo-DCs經(jīng)LPS刺激24 h后可分化發(fā)育為成熟Mo-DCs,成熟 Mo-DCs 的 SWC3a~+CD1a~+、SWC3a~+CD80/86~+、SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+的表達(dá)量可以達(dá)到66.17%、81.16%和34.30%。同時(shí)在吞噬試驗(yàn)中未成熟、成熟DCs的結(jié)果也符合DCs的相關(guān)生物學(xué)特性,這些結(jié)果均表明本試驗(yàn)分離培養(yǎng)到了高純度的豬單核源DCs,可以進(jìn)行下一步的試驗(yàn)研究。2豬流行性腹瀉病毒及其滅活毒對(duì)體外培養(yǎng)的豬單核源樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響PEDV的主要靶組織是仔豬小腸上皮,而在仔豬小腸上皮下廣泛地分布著大量的DCs,DCs不僅在監(jiān)視和抵御病毒入侵的過(guò)程中起到重要作用,同時(shí)還可以激活機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。為了探究PEDV及其滅活毒對(duì)豬DCs免疫功能的影響,我們用分離培養(yǎng)的仔豬單核源樹(shù)突狀細(xì)胞(Mo-DCs)與PEDV及其滅活毒共同作用,首先通過(guò)熒光定量和病毒滴度檢測(cè)PEDV對(duì)Mo-DCs細(xì)胞是否感染,再用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)PEDV及其滅活毒對(duì)選取的相關(guān)Mo-DCs細(xì)胞表面分子的表達(dá)量和細(xì)胞因子分泌量的影響,最后通過(guò)混合T淋巴反應(yīng)試驗(yàn)驗(yàn)證Mo-DCs在PEDV及其滅活毒的作用下對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明,PEDV可以低水平感染未成熟、成熟Mo-DCs,并且未成熟Mo-DCs的易感性要高于成熟Mo-DCs;與對(duì)照組相比,PEDV及其滅活毒可以顯著的增加未成熟、成熟Mo-DCs表面分子CD1a~+、CD80/86~+和SLA-Ⅱ-DR~+表達(dá)量(P0.05);PEDV及其滅活毒可以使未成熟、成熟Mo-DCs分泌IL-12和IFN-γ顯著高于對(duì)照組(P0.05);未成熟、成熟Mo-DCs在PEDV及其滅活毒的作用下能顯著的刺激T細(xì)胞增殖(P0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明PEDV及其滅活毒可以顯著提高M(jìn)o-DCs的抗原遞呈、IL-12和IFN-γ的分泌以及刺激T細(xì)胞增殖的能力。3豬流行性腹瀉病毒弱毒株及其滅活毒對(duì)仔豬腸道樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證PEDV及其滅活毒對(duì)仔豬DCs免疫功能的影響,我們通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)體外試驗(yàn)得到的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)首先給仔豬進(jìn)行腸結(jié)扎手術(shù),向結(jié)扎腸段中注射PEDV及其滅活毒,通過(guò)免疫熒光和免疫組化的方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)仔豬小腸絨毛和固有層 SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs、CD11b~+CD16~+DCs、CD3~+、CD4~+和 CD8~+T細(xì)胞的數(shù)量變化,從而驗(yàn)證腸道DCs在PEDV及其滅活毒作用后免疫功能的變化情況。結(jié)果顯示:注射PEDV 3 h后,仔豬腸道固有層SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+DCs數(shù)目顯著增加(P0.05)。48 h之后,仔豬腸道絨毛上SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs 和 CD11b~+CD16~+DCs數(shù)目顯著增加(P0.05)。這說(shuō)明在仔豬受到PEDV感染早期,腸道中的SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+ DCs和CD11b~+CD16~+ DCs會(huì)迅速經(jīng)固有層向腸系膜淋巴結(jié)遷移,并且在持續(xù)感染中,機(jī)體通過(guò)增加小腸絨毛DCs來(lái)增強(qiáng)遞呈抗原能力。而給仔豬注射PEDV及其滅活毒15 min、3 h和48 h時(shí)間點(diǎn),小腸絨毛、腸道固有層中的CD3~+、CD4~+和CD8~+T細(xì)胞相比對(duì)照組均呈現(xiàn)出顯著增加(P0.05)。這說(shuō)明PEDV及其滅活毒可以通過(guò)增加腸道DCs遞呈功能而顯著刺激CD3~+、CD4~+和CD8~+ T細(xì)胞的增殖能力。為了進(jìn)一步研究PEDV及其滅活毒對(duì)腸道DCs抗原遞呈功能的影響,本試驗(yàn)給仔豬免疫PEDV及其滅活毒48 h后,用腸結(jié)扎手術(shù)向仔豬結(jié)扎腸段注射模式抗原-滅活大腸桿菌K88,用免疫熒光和免疫組化的方法檢測(cè)仔豬小腸絨毛和腸道固有層SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs、CD11b~+CD16~+DCs、CD3~+、CD4~+和 CD8~+T 細(xì)胞的數(shù)目變化。結(jié)果表明,注射滅活K88 3 h后,各組仔豬腸道絨毛內(nèi)SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+DCs的數(shù)量減少,而各處理組的仔豬腸道固有層SWC3a~+SLA-Ⅱ-DR~+DCs和CD11b~+CD16~+ DCs數(shù)量顯著增加(P0.05),這說(shuō)明仔豬小腸絨毛中的DCs可能已經(jīng)向腸道固有層中進(jìn)行遷移。而仔豬經(jīng)PEDV及其滅活毒免疫48 h后再注射滅活K88 15 min和3 h,各處理組中仔豬小腸絨毛和固有層內(nèi)CD3~+、CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的數(shù)量均呈現(xiàn)顯著增加(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明腸道樹(shù)突狀細(xì)胞在PEDV弱毒株CV777及其滅活毒的作用下,其抗原遞呈和刺激T細(xì)胞增殖等免疫功能得到增強(qiáng),這為研究PEDV的致病機(jī)制以及疫苗的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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2 甘振磊;湯德元;李春燕;王彬;張曉杰;王鳳;劉志杰;;豬流行性腹瀉流行特點(diǎn)及流行現(xiàn)狀的研究[J];豬業(yè)科學(xué);2010年12期

3 郭建巍,蔡美英;用GM-CSF和IL-4在體外誘導(dǎo)高純度CD14~+樹(shù)突狀細(xì)胞[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2002年02期

4 佟有恩,馮力,李偉杰,王明,馬思奇;豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J];中國(guó)畜禽傳染病;1998年06期

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本文編號(hào)：2437887