【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是豬的革拉斯氏病的病原體,可引起以豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎等癥狀。近年來,隨著我國規(guī)�；B(yǎng)豬場的發(fā)展,該病已經(jīng)成為豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一。本研究對2012年-2014年期間江西地區(qū)HPS臨床分離株在已進行瓊脂擴散試驗方法血清型分型基礎(chǔ)上進行ERIC-PCR基因型分析。通過對副豬嗜血桿菌hhd A基因克隆,并在進行HPS hhd A蛋白生物學信息預測的基礎(chǔ)上,將HPS hhd A蛋白進行原核表達與鑒定,以及進一步研究其免疫原性,具體如下:1、2012年-2014年江西地區(qū)HPS分離株ERIC-PCR基因分型研究以15株副豬嗜血桿菌不同血清型的標準菌株為參照,對2012~2014年江西地區(qū)的41株HPS分離株進行基因分型,總共56株菌(41株HPS江西分離株和15株參考菌株)被分為44個基因型,之前無法通過血清分型的8株菌株均得到ERIC-PCR基因分型充分分型,從而彌補了傳統(tǒng)血清分型方法不能完全分型的缺陷。2、副豬嗜血桿菌hhd A基因的克隆與生物信息學分析本研究應用PCR技術(shù)成功的擴增了副豬嗜血桿菌的hhd A基因序列,獲得了長1797bp的hhd A基因,編碼599個氨基酸,推導出蛋白質(zhì)的分子量大小為61.1k Da的親水性蛋白;該蛋白由內(nèi)向外和由外向內(nèi)各有可能一個跨膜區(qū)域;通過蛋白質(zhì)的信號肽預測hhd A蛋白無信號肽,為細胞內(nèi)蛋白;對hhd A蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行了預測和分析,結(jié)果顯示hhd A含有較多α-螺旋、β-折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu),而且有較多柔性區(qū)域,呈散在分布。與Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384)中對應的核苷酸序列同源性為99.9%,氨基酸同源性99.8%,測定表明HPS的hhd A基因十分保守。3、HPS hhd A基因的原核表達及其免疫保護作用的研究將擴增的hhd A基因克隆于原核表達載體p ET-32a(+)中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒p ET-32a(+)-hhd A,后轉(zhuǎn)化至受體菌E.coli BL21(DE3),IPTG誘導表達,通過SDS-PAGE和Western blot分析重組hhd A蛋白的表達情況和反應原性。重組蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后免疫小鼠,檢測其特異性血清Ig G抗體水平及攻毒保護率。結(jié)果表明,SDS-PAGE得到約82 KDa與預期分子質(zhì)量大小一致蛋白;Western blot分析顯示,該重組蛋白具有良好反應原性。動物免疫保護試驗結(jié)果表明,重組hhd A蛋白免疫后能誘導產(chǎn)生高水平的hhd A特異性抗體,并對副豬嗜血桿菌強毒菌株的攻擊的提供50%保護率,說明hhd A是副豬嗜血桿菌的一種保護性抗原。
[Abstract]:Haemophilus paraswine (Haemophilus parasuis,HPS) is the pathogen of porcine Graillard disease, which can cause polyserositis and arthritis. In recent years, with the development of large-scale pig farms in China, the disease has become one of the important reasons for the increase of pig morbidity and mortality. In this study, the clinical isolates of HPS from 2012 to 2014 in Jiangxi province were analyzed for ERIC-PCR genotypes on the basis of serotyping of Agar diffusion test method. By cloning the hhd A gene of Haemophilus parais and predicting the biological information of HPS hhd A protein, the prokaryotic expression and identification of HPS hhd A protein were carried out, and the immunogenicity of HPS hhd A protein was further studied. The main results are as follows: 1. According to 15 standard strains of Haemophilus parasuis serotype, 41 HPS isolates in Jiangxi from 2012 to 2014 were genotyped by ERIC-PCR genotyping. A total of 56 strains (41 HPS Jiangxi isolates and 15 reference strains) were classified into 44 genotypes. All 8 strains that could not be genotyped by serum were fully genotyped by ERIC-PCR genotyping. 2. Cloning and bioinformatics analysis of the hhd A gene of Haemophilus parasuis. The hhd A gene sequence of Haemophilus parasuis was successfully amplified by PCR technique. The long 1797bp hhd A gene was obtained, encoding 599 amino acids, and the hydrophilic protein with molecular weight of 61.1 k Da was deduced. There is a transmembrane region from inside to outside and from outside to inside, and the signal peptide of hhd A is predicted to be an intracellular protein by the signal peptide of the protein. The secondary structure of hhd A protein was predicted and analyzed. The results showed that hhd A had more secondary structures, such as 偽 -helix, 尾 -fold, 尾 rotation angle and irregular crimp, and there were more flexible regions and scattered distribution. The homology of nucleotide sequence and amino acid sequence of ZJ0906 strain (CP005384) published on Gen Bank was 99.9 and 99.8 respectively. The results showed that the hhd A gene of HPS was very conserved. Prokaryotic expression of HPS hhd A Gene and its Immunoprotective effect; the amplified hhd A gene was cloned into the prokaryotic expression vector p ET-32a () to construct the recombinant expression plasmid p ET-32a ()-hhd A. The expression of recombinant hhd A protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The expression and reactivity of recombinant hhd A protein were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The recombinant protein was purified by nickel column affinity chromatography to immunize mice, and its specific serum Ig G antibody level and protection rate against virus were detected. The results showed that the SDS-PAGE obtained about 82 KDa and the expected molecular weight consistent protein; Western blot analysis showed that the recombinant protein had good reactivity. The results of animal immune protection test showed that recombinant hhd A protein could induce the production of high level of hhd A specific antibody after immunization, and provide 50% protection against the attack of Haemophilus parahaemophilus virulent strain. Hhd A is a protective antigen of Haemophilus parasuis.
【學位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S855.12

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本文編號：2396327