【摘要】：鉛(Pb)是生態(tài)環(huán)境中的一種常見(jiàn)污染物,一旦進(jìn)入生物機(jī)體便在體內(nèi)蓄積并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。鉛對(duì)機(jī)體的損傷呈多系統(tǒng)和多器官性。腎臟是鉛損傷的重要靶器官,且近端小管是鉛腎臟損傷的靶部位。細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化上高度保守、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)過(guò)程,主要通過(guò)溶酶體對(duì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白,錯(cuò)誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器進(jìn)行降解并循環(huán)利用。研究表明細(xì)胞自噬在多種毒物所致腎臟損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用,但細(xì)胞自噬在鉛所致大鼠腎小管上皮(rPT)細(xì)胞毒性中的具體機(jī)制尚不清楚。溶酶體是細(xì)胞自噬降解過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞器。當(dāng)外界刺激誘發(fā)溶酶體膜通透化時(shí),組織蛋白酶B和組織蛋白酶D從溶酶體釋放進(jìn)入胞漿,可激活細(xì)胞凋亡途徑而發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。我們前期研究證實(shí)細(xì)胞凋亡是低劑量鉛(0-1.0μM)暴露所致rPT細(xì)胞死亡的主要途徑,但溶酶體膜通透化是否參與該過(guò)程尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于溶酶體在細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡中的雙重調(diào)控作用,本研究以原代rPT細(xì)胞為研究對(duì)象,重點(diǎn)探討溶酶體功能異常,細(xì)胞凋亡與自噬抑制三者之間的關(guān)系,為從分子水平揭示鉛對(duì)腎臟的毒性損傷機(jī)理提供理論依據(jù)。首先,本研究對(duì)鉛所致自噬小體蓄積的原因進(jìn)行了探究。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)鉛暴露不同時(shí)間(3,6,12 h)自噬標(biāo)志蛋白LC3-II的表達(dá)情況來(lái)反映鉛對(duì)自噬的影響,篩選出自噬現(xiàn)象最明顯時(shí)的鉛暴露時(shí)間和劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。結(jié)果表明鉛暴露可引起自噬小體的蓄積,在鉛濃度為0.5μM,處理時(shí)間為12 h時(shí),自噬小體蓄積最明顯。采用兩種自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬前期)和氯喹(CQ,自噬后期)干預(yù)自噬,通過(guò)共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)兩種自噬抑制劑對(duì)鉛所致GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的rPT細(xì)胞中自噬小體數(shù)量變化的影響。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)在兩種自噬抑制劑存在或不存在情況下對(duì)鉛所致自噬標(biāo)志蛋白LC3-II和p62/SQSTM1表達(dá)的影響。通過(guò)共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)鉛對(duì)RFP-GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的rPT細(xì)胞中自噬小體向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,進(jìn)一步確定鉛對(duì)rPT細(xì)胞自噬流的影響。結(jié)果表明鉛通過(guò)抑制自噬引起自噬小體蓄積。其次,我們對(duì)自噬流抑制的具體機(jī)制進(jìn)行了研究。采用內(nèi)源性LC3免疫熒光著色標(biāo)記自噬小體,LAMP1免疫著色標(biāo)記溶酶體,通過(guò)共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)鉛暴露對(duì)自噬小體和溶酶體融合的影響。使用Lyso-Tracker Red和Acridine Orange兩種溶酶體pH探針標(biāo)記溶酶體,并通過(guò)共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)鉛對(duì)rPT細(xì)胞溶酶體pH的影響。隨后通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)鉛對(duì)調(diào)控細(xì)胞溶酶體酸性環(huán)境的3種V-ATPase蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明鉛可能通過(guò)抑制2種溶酶體V-ATPases表達(dá)而升高溶酶體pH。采用共聚焦顯微技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分別檢測(cè)鉛對(duì)DQ-BSA-Green熒光強(qiáng)度和細(xì)胞總組織蛋白酶B、D蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明鉛所致自噬阻滯不是由自噬小體與溶酶體融合受阻引起,而是由溶酶體功能受損(包括溶酶體堿化和溶酶體降解能力降低)引起。最后,我們對(duì)溶酶體膜通透化與細(xì)胞凋亡的聯(lián)系進(jìn)行了研究。采用共聚焦顯微技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分別檢測(cè)鉛對(duì)組織蛋白酶B、D亞細(xì)胞分布的影響。同時(shí),采用CA 074(組織蛋白酶B抑制劑)和Pep A(組織蛋白酶D抑制劑)分別預(yù)處理rPT細(xì)胞隨后進(jìn)行鉛染毒,通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、共聚焦顯微技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CA 074或Pep A與鉛共處理對(duì)鉛處理所致凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3剪切體、DAPI著染的細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞凋亡率變化的影響。結(jié)果表明鉛可引起溶酶體膜通透化,導(dǎo)致組織蛋白酶B、D由溶酶體釋放進(jìn)入胞漿,進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡�？傊�,鉛暴露所致溶酶體功能受損(溶酶體堿化和溶酶體蛋白水解酶活性降低)導(dǎo)致自噬抑制,自噬流的阻滯導(dǎo)致腎毒性;鉛介導(dǎo)的溶酶體膜通透化可導(dǎo)致組織蛋白酶B、D由溶酶體釋放進(jìn)入胞漿進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,引起腎毒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S859.82

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 石貞玉;厲永強(qiáng);;自噬的雙重功能[J];黑龍江科技信息;2014年19期

2 朱明月,周鵬;凋亡與自噬性死亡[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年02期

3 王棋文;王濤;姚路連;王怡;袁燕;顧建紅;劉學(xué)忠;卞建春;劉宗平;;自噬在鎘致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年09期

4 ;中國(guó)科學(xué)家確認(rèn)30多個(gè)水稻自噬相關(guān)基因[J];生物學(xué)教學(xué);2012年04期

5 張微;孫鴻;邢莉萍;衛(wèi)曉靜;王華忠;;小麥自噬相關(guān)基因ATG10的克隆及白粉菌侵染誘導(dǎo)的ATG10的表達(dá)[J];作物學(xué)報(bào);2014年08期

6 朱家橋;王玲玲;程來(lái)洋;王棋文;王亨;劉學(xué)忠;劉宗平;;鎘對(duì)體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞自噬的影響[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年12期

7 戴漢川;黃春曉;呂新慧;王寧;伍曉雄;;脂多糖對(duì)斷奶仔豬胸腺自噬Beclin-1基因的表達(dá)分析[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 韋雪;漆永梅;張迎梅;;鎘、活性氧自由基與自噬發(fā)生的分子機(jī)制[A];中國(guó)活性氧生物學(xué)效應(yīng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集（第一冊(cè)）[C];2011年

2 秦正紅;粱中琴;陶陸陽(yáng);黃強(qiáng);劉春風(fēng);蔣星紅;倪宏;邢春根;;自噬在細(xì)胞生存與死亡中的作用[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

3 秦正紅;;自噬與腫瘤和神經(jīng)細(xì)胞生存——藥物作用的新靶位[A];全國(guó)生化與分子藥理學(xué)藥物靶點(diǎn)研討會(huì)論文摘要集[C];2008年

4 李芹;丁壯;;自噬功能研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第八屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

5 胡晨;張璇;滕衍斌;胡海汐;周叢照;;家蠶中自噬相關(guān)蛋白Atg8的結(jié)構(gòu)研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

6 陳希;李民;Xiao-Ming Yin;李林潔;;通過(guò)不同途徑誘導(dǎo)自噬的化合物對(duì)Atg9的依賴(lài)性不同[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2013年全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)·武漢論文摘要集[C];2013年

7 陳涓涓;敬靜;蔡元博;張俊龍;;針對(duì)活體細(xì)胞自噬行為的發(fā)光金屬配合物的設(shè)計(jì)[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第8分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2012年

8 寧曉潔;鐘自彪;王彥峰;付貞;葉啟發(fā);;缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞自噬[A];2013中國(guó)器官移植大會(huì)論文匯編[C];2013年

9 吳曉琦;李丹丹;鄧蓉;江山;楊芬;馮公侃;朱孝峰;;CaMKKβ磷酸化Beclin 1調(diào)控自噬及其在腫瘤治療中的作用[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

10 周鴻雁;裴中;陳杰;申存周;錢(qián)浩;劉妍梅;冼文彪;鄭一帆;陳玲;;線粒體動(dòng)力改變參與了LRRK2突變導(dǎo)致的自噬[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 生命學(xué)院;俞立課題組在《科學(xué)》發(fā)文揭示自噬調(diào)控的重要機(jī)制[N];新清華;2012年

2 周飛 張粹蘭;花櫚木“自噬”可抗癌[N];廣東科技報(bào);2011年

3 張明永;水稻自噬基因研究取得新進(jìn)展[N];廣東科技報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 賈盛楠;轉(zhuǎn)錄因子p8調(diào)控自噬的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 皮會(huì)豐;DNM1L蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬在鎘致肝臟毒性中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 李倩;miRNAs介導(dǎo)的自噬抑制在類(lèi)鼻疽桿菌感染免疫逃逸中的作用機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 黎炳護(hù);激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細(xì)胞泡沫化中作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 陳江偉;自噬在椎間盤(pán)退變中的作用及機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2014年

6 李榮榮;自噬在布比卡因肌毒性中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

7 王維;NF-κB信號(hào)通路參與介導(dǎo)的自噬在高血壓大鼠心血管重構(gòu)的作用研究[D];山東大學(xué);2015年

8 劉春朋;日糧硒缺乏對(duì)雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)及自噬變化的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 梁蓓蓓;P53凋亡刺激蛋白ASPP2調(diào)控細(xì)胞自噬的研究[D];上海交通大學(xué);2012年

10 袁揚(yáng);線粒體自噬的抗缺血性腦損傷作用及其調(diào)控機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 匡紅;Jnk2通過(guò)smARF的降解來(lái)調(diào)控壓力誘導(dǎo)的線粒體自噬及組織損傷[D];浙江理工大學(xué);2015年

2 洪永桃;自噬在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的作用及甲氨蝶呤對(duì)自噬的影響[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 李寧;自噬在嗎啡心肌保護(hù)中的作用及機(jī)制研究[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

4 劉冰;腦缺血預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后自噬及凋亡的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

5 王存凱;microRNA-30a-5p通過(guò)抑制自噬阻止肝星狀細(xì)胞激活[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 張宇程;泛素連接酶HOIL-1L在線粒體自噬中的功能與機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

7 唐芙蓉;自噬對(duì)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

8 陳軍童;腎損傷分子1對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬作用的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

9 包勇;Kap1在LBH589誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7自噬形成中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

10 魏園玉;P53缺失型HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)Nucleostemin下調(diào)對(duì)mTOR通路介導(dǎo)的自噬活性的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2387851