【摘要】：本研究從生態(tài)養(yǎng)殖場健康仔豬盲腸及糞便樣品中篩選凝結(jié)芽孢桿菌,并對菌株的益生特性及安全性進行研究,最終獲得益生性能良好且無毒、無抗生素抗性的凝結(jié)芽孢桿菌BC303;通過階段控制策略實現(xiàn)了該菌體的高密度培養(yǎng)與快速芽孢化,并借助轉(zhuǎn)錄組測序?qū)C303芽孢化形成過程的關(guān)鍵節(jié)點進行研究,初步構(gòu)建了BC303的芽孢化起始途徑及相關(guān)調(diào)控模型。主要研究結(jié)果如下:1、從生態(tài)養(yǎng)殖場健康仔豬盲腸及糞便樣品中篩選得到40余株芽孢桿菌,經(jīng)形態(tài)學、生理生化分析及16S rDNA鑒定,獲得4株凝結(jié)芽孢桿菌,分別命名為BC147、BC235、BC310和BC303。四株菌均具有良好粘附能力,并對膽鹽和低酸環(huán)境表現(xiàn)出較強的耐受能力,其中BC303對仔豬腸黏液的黏附率高達41.67%,在pH 4的條件下其營養(yǎng)細胞存活率高達91.0%,在0.3%膽鹽中暴露2小時,其存活率仍維持在40%以上。病原菌拮抗試驗發(fā)現(xiàn),四株菌對常見腸道病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌作用,其中對Salmonella typhimurium ATCC 13311高度抑制;同時,四株菌均具有良好的蛋白酶和纖維素酶產(chǎn)生能力,且對不同種類的獸用抗生素均具有不同程度的敏感,其中BC303對所測試抗生素均高度敏感。將BC303作為候選益生菌進行小鼠飼喂試驗,結(jié)果表明,該菌株具有良好的安全性,且能提高小鼠的飼料轉(zhuǎn)化率、免疫能力和日增重。2、以候選益生菌BC303為研究對象,通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化對其發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行研究,最終確定其最佳培養(yǎng)條件為時間20h,初始pH8.0,培養(yǎng)溫度37℃,轉(zhuǎn)速230rpm,接種量3%;發(fā)酵培養(yǎng)基各組分最佳配比:葡萄糖15.80g/L,蛋白胨15.90g/L,酵母粉11g/L,MgSO4 4.60g/L。以8h添加15g/L葡萄糖為最佳補糖方案,可使BC303的營養(yǎng)細胞密度升高至2.13×1010CFU/mL;在此基礎(chǔ)上,以16h添加1.8g碳酸鈣+1g麩皮+0.1mg異亮氨酸為最佳促孢方案,可使其芽孢量達到1.3×108CFU/mL;對產(chǎn)孢階段的發(fā)酵條件進行研究發(fā)現(xiàn),40℃、280rpm為其最優(yōu)產(chǎn)孢條件。通過促孢因子的篩選、添加及產(chǎn)孢階段發(fā)酵條件的優(yōu)化,BC303孢子量提高至8.4×108CFU/mL。3、通過原核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序?qū)δY(jié)芽孢桿菌BC303芽孢化關(guān)鍵節(jié)點進行研究,初步構(gòu)建了其芽孢化起始通路及相關(guān)調(diào)控模型。BC303芽孢化可能以組氨酸蛋白激酶KinC、KinE的自我磷酸化為起點,隨后將磷酸傳遞給磷酸傳遞蛋白Spo0F及Spo0B,最終實現(xiàn)產(chǎn)孢轉(zhuǎn)錄因子Spo0A的磷酸化而導致孢子的產(chǎn)生;同時,KinC自我磷酸化后亦可能繞過Spo0F、Spo0B,直接將磷酸基團傳遞給Spo0A使其活化而啟動芽孢化過程,在該過程中Spo0A的活性受菌體密度、DNA損傷、氧化還原狀態(tài)、營養(yǎng)條件及去磷酸化作用等因素的影響。其中Opp、AIP、dnaA、LexA可間接調(diào)控組氨酸蛋白激酶的自我磷酸化水平;sda、codY-GTP直接抑制組氨酸蛋白激酶的自我磷酸化;Spo0A-PO4易受到Spo0E的去磷酸化作用。上述調(diào)控方式最終將導致Spo0A的表達量以及磷酸化水平的變化,可能對凝結(jié)芽孢桿菌孢子啟動和形成過程進行調(diào)節(jié)。
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【學位授予單位】：河南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S816.3

【參考文獻】

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本文編號：2379256